李強,齊楠,楊麗文,李華,王軼南

(大連海洋大學農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學重點開放實驗室,遼寧大連116023)

黃海希瓦氏菌多克隆抗體部分特性的分析

李強,齊楠,楊麗文,李華,王軼南

(大連海洋大學農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學重點開放實驗室,遼寧大連116023)

采用免疫學方法,以仿刺參Apostichopus japonicus“化皮病”病原菌——黃海希瓦氏菌Shewanella marisflavi AP629福爾馬林滅活疫苗作為免疫原,對新西蘭大白兔進行免疫,制備了高效價的多克隆抗體。通過間接酶聯(lián)免疫、間接免疫熒光和免疫印跡等技術對多克隆抗體的部分特性進行了分析。結果表明:獲得的多克隆抗體的效價為1∶32768;多抗與黃海希瓦氏菌標準菌株存在很強的陽性反應,與弧菌和氣單胞菌、鏈球菌和大腸桿菌交叉反應很弱或不存在交叉反應;多抗不僅與菌體本身反應,與菌株表面的分泌物也發(fā)生特異性結合。免疫印跡結果顯示,多克隆抗體與黃海希瓦氏菌AP629結合的抗原決定簇主要蛋白帶有6條,相對分子質量分別為131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白條帶的抗原性最強;與胞外產(chǎn)物結合的抗原決定簇清楚的蛋白條帶主要有3條,相對分子質量分別為62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白條帶的信號最強。

仿刺參;黃海希瓦氏菌;多克隆抗體

希瓦氏菌Shewanella是人畜共患的條件性致病菌[1-2],通常分離于淡水和海洋中,但同時也具有廣闊的工業(yè)和環(huán)境保護方面的應用前景,因此越來越受到學者們的廣泛關注。關于希瓦氏菌引發(fā)水產(chǎn)動物的疾病報道很少,陳償?shù)萚3]曾報道海藻希瓦氏菌Shewanella algae可引起養(yǎng)殖紅擬石首魚Scinenops ocellata發(fā)生潰瘍病;Li等[4]曾報道黃海希瓦氏菌Shewanella marisflavi可引起養(yǎng)殖仿刺參Apostichopus japonicus發(fā)生化皮病。

關于黃海希瓦氏菌的研究報道很少。最早是由Yoon等[5]于2004年從黃海中分離得到,通過生理生化特征鑒定、脂肪酸成分分析、DNA G+C含量、16S rDNA基因序列分析以及DNA-DNA雜交,將分離株SW-117鑒定為新種——黃海希瓦氏菌。2006年,Bharathkumar等[6]報道了該菌可以分離自土壤中。2004年大連海洋大學農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學重點開放實驗室自患“化皮病”的仿刺參中分離到一株黃海希瓦氏菌AP629,經(jīng)感染試驗確定該菌為仿刺參的病原菌[4]。本試驗中,作者在前期研究的基礎上,采用免疫學方法制備了該菌的多克隆抗體,并對其特性進行了分析,旨在以該多克隆抗體為工具,建立對該病原菌快速、靈敏的免疫學檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黃海希瓦氏菌AP629由大連海洋大學農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學重點開放實驗室提供。黃海希瓦氏菌S.marisflavi(KCCM 41822)、創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus(ATCC 29306)、哈維弧菌V.harveryi (ATCC 14126)、溶藻弧菌V.alginolacticus(KCCM 40513)、鰻弧菌V.anguillarum(HUFP 5001)、河流弧菌V.fluvialis(KCCM 40827)、副溶血弧菌V.parahaemolyticus(KCTC2471)、最小弧菌V.minicus(ATCC 33653)、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida(MT 004)、海豚鏈球菌Streptococcus iniae(KCTC 3657)、大腸桿菌Escherichia coli(ATCC 29532)均由韓國釜慶大學疾病預防實驗室贈送。健康的成年雌性新西蘭大白兔,體質量約2 kg,購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。弗氏完全佐劑及不完全佐劑、用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG、用堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗兔IgG、對硝基苯磷酸鹽(pNPP)、氯化硝基四唑藍(NBT)、5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸(BCIP)均購自Sigma公司。

1.2 多克隆抗體的制備

1.2.1 抗原的制備 將黃海希瓦氏菌AP629接種于2216E培養(yǎng)基上,28℃下培養(yǎng)24 h;用玻璃刮刀將菌體刮下來,以8 000 r/min離心20 min;去除培養(yǎng)基,以生理鹽水重懸、離心,洗滌兩次,再重懸于體積分數(shù)為0.5%的福爾馬林溶液中,于4℃下過夜滅活。用生理鹽水洗滌兩次,離心,收集菌體,所得菌體用生理鹽水重懸。取菌液100 μL涂布于平板上,進行活菌檢驗,檢測無活菌后,置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗動物的免疫 將黃海希瓦氏菌AP629滅活細菌的數(shù)量調至108個/mL,用來免疫純系新西蘭大白兔,共免疫3次。具體免疫程序如下:基礎免疫,將滅活細菌與弗氏完全佐劑等比混勻,采用皮下注射免疫,共注射6點,每點注射0.2 mL; 2周后加強免疫,將滅活細菌與弗氏不完全佐劑等比混勻,接種方法與基礎免疫相同;1周后再加強免疫1次。在第一次免疫試驗前,從兔耳靜脈采血,分離血清,作為陰性對照。

1.2.3 抗血清的采集 對新西蘭白兔進行第3次免疫后的第7天,進行頸動脈插管放血。將血樣在室溫放置1 h后,于4℃下過夜,次日在4℃下以3 500 r/min離心20 min,分離抗血清,分裝,于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多克隆抗體的特性分析

1.3.1 抗體效價的測定 采用棋盤滴定法測定抗體效價。將黃海希瓦氏菌AP629用碳酸鹽包被液進行10倍梯度稀釋,包被于96孔酶標板上,100 μL/孔,4℃下過夜。次日用含體積分數(shù)為0.05%的吐溫-磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次,每次5 min;每孔滴加200 μL 30 mg/mL的牛血清白蛋白(PBS配制),于37℃下封閉1 h;經(jīng)PBST洗滌3次,加入100 μL按照2倍梯度稀釋的抗血清,37℃下孵育1 h;經(jīng)洗滌,加入100 μL用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(1∶30 000),37℃下孵育1 h;洗滌后滴加100 μL pNPP應用液,在暗處反應20 min,在405 nm波長下測定OD值。以正常兔血清作為陰性對照,呈現(xiàn)陽性反應的抗體最大稀釋度為待測樣品的效價。

1.3.2 間接免疫熒光 將黃海希瓦氏菌AP629的數(shù)量調至5×106個/mL,取20 μL滴于載玻片上, 37℃下沉降1 h,用丙酮固定20 min。滴加相應的抗血清(1∶100)于載玻片上,37℃下孵育1 h,用PBS浸洗3次,每次洗滌5 min。滴加用FITC標記的羊抗兔IgG(1∶200),37℃下孵育1 h,再用PBS浸洗3次,每次洗5 min。用甘油封片后,在熒光顯微鏡下觀察,以正常兔血清作為陰性對照。

1.3.3 胞外產(chǎn)物(ECP)的制備及與多抗的交叉反應 用平板玻璃紙法[7-8]制備黃海希瓦氏菌AP629的ECP,采用考馬斯亮藍法[9]測定蛋白質的含量,以牛血清白蛋白為標準。以間接酶聯(lián)免疫技術檢測ECP與多抗的交叉反應,多抗稀釋度1∶100,酶標二抗稀釋度1∶30 000,操作方法同抗體效價測定。

1.3.4 多抗與其它菌株的交叉反應 以間接酶聯(lián)免疫技術檢測所獲多克隆抗體與其它菌株的交叉反應。測試菌株包括:黃海希瓦氏菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、最小弧菌、殺鮭氣單胞菌、海豚鏈球菌和大腸桿菌11種標準菌株?？乖粷舛葹?07個/mL,多抗稀釋度為1∶100,酶標二抗稀釋度為1∶30 000,操作方法同抗體效價的測定。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western-Blot) SDS -PAGE和Western-blot均按照常規(guī)操作方法進行[10],電泳凝膠由質量分數(shù)為12%的分離膠和質量分數(shù)為5%的濃縮膠組成。簡單描述如下:將黃海希瓦氏菌AP629及其ECP與電泳樣品緩沖液等體積混合,采用Tris-甘氨酸(Gly)電泳緩沖液進行電泳,一面膠用考馬斯亮藍進行染色,另一面膠用于電轉移,轉移后的硝酸纖維素膜(NC膜)按照常規(guī)的免疫學方法進行染色。

2 結果

2.1 抗體

經(jīng)采血、離心處理后,獲得抗黃海希瓦氏菌AP629的多克隆抗體22 mL。

2.2 抗體的效價

將多克隆抗體從128倍開始進行倍比稀釋,經(jīng)棋盤滴定法測定,當抗體稀釋至1∶32 768時,測定的OD405nm值與陰性對照的OD405nm值之比P/N＞2.1,稀釋至1∶65 536時,P/N＜2.1。本試驗中制備的抗黃海希瓦氏菌AP629多克隆抗體效價為1∶32 768,達到了很高的效價。

2.3 間接免疫熒光

從圖1可見,細菌滴片中黃海希瓦氏菌AP629及非菌體部分均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光信號,陰性對照中無熒光信號。

圖1 免疫熒光反應的試驗結果Fig.1 The result of immunofluorescence

2.4 多抗與菌株AP629胞外產(chǎn)物的交叉反應

采用平板玻璃紙法共獲得菌株AP629胞外產(chǎn)物8 mL,用考馬斯亮藍測定的蛋白濃度為3 mg/mL。采用間接ELISA法測定多抗與胞外產(chǎn)物反應的P/N值為4.2(＞2.1),說明多抗與菌株AP629胞外產(chǎn)物存在交叉反應。

2.5 多抗與其它菌株的交叉反應

經(jīng)間接ELISA法測定,抗黃海希瓦氏菌AP629多克隆抗體與黃海希瓦氏菌標準菌株存在很強的陽性反應,與弧菌屬中的創(chuàng)傷弧菌和河流弧菌有微弱的交叉反應,與弧菌屬中的其它種類及殺鮭氣單胞菌、海豚鏈球菌和大腸桿菌存在極弱或不存在交叉現(xiàn)象(表1)。

表1 交叉反應的試驗結果Tab.1 The result of cross-reactivity

2.6 SDS-PAGE和免疫印跡

SDS-PAGE結果顯示,菌株AP629與其胞外產(chǎn)物含有很多相同的蛋白帶,但含量存在一定差異。免疫印跡結果顯示,多克隆抗體與全菌結合的抗原決定簇主要蛋白帶有6條,相對分子質量分別為131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白條帶的抗原性最強;多克隆抗體與胞外產(chǎn)物結合的抗原決定簇清楚的蛋白條帶主要有3條,相對分子質量分別為62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白條帶的信號最強。

圖2 SDS-PAGE和Western-blot結果Fig.2 The results of SDS-PAGE and Western-blot

3 討論

黃海希瓦氏菌AP629為本實驗室從大連地區(qū)患病仿刺參中分離獲得。感染試驗證明,該菌像其它病原菌如燦爛弧菌[11]、假交替單胞菌[12]等一樣可引發(fā)仿刺參成參和幼參出現(xiàn)化皮、腫嘴、吐腸等臨床癥狀,且毒力強于燦爛弧菌和假交替單胞菌。由于黃海希瓦氏菌是近幾年發(fā)現(xiàn)的新種,針對該菌的研究還很不系統(tǒng),關于該菌的診斷還主要依靠常規(guī)的生理、生化分析和16S rDNA基因等分子生物學檢測方法,其耗時久,且需要特殊的專業(yè)技術,這在很大程度上限制了該病的快速診斷,容易延誤治療時機。免疫學方法雖然靈敏度偏低,但其操作簡便,耗時短,與細菌的常規(guī)培養(yǎng)技術相結合,完全可在短時間內(nèi)對病原菌進行準確診斷[13-14]。

本試驗中通過免疫新西蘭大白兔獲得了抗黃海希瓦氏菌AP629的多克隆抗體22 mL,效價為1∶32 768,高效價、高質量的抗體為進一步應用奠定了堅實的基礎。多克隆抗體由于具有一定的特異性、靈敏性,且制備相對容易,因此多用來制備二抗,如在雙抗夾心ELISA中就需要多抗[15]。本試驗中制備的抗黃海希瓦氏菌AP629的多克隆抗體效價高、特異性強,與弧菌、氣單胞菌和鏈球菌等水產(chǎn)動物病原菌之間交叉反應很弱或無交叉反應。因此,將本試驗中制備的多抗與已制備的單克隆抗體(另文發(fā)表)相結合,建立針對黃海希瓦氏菌AP629的雙抗夾心ELISA檢測方法,該法可應用于生產(chǎn)實踐,以適應不同層次的需要。

間接免疫熒光結果顯示,細菌滴片中黃海希瓦氏菌AP629及非菌體部分均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光信號,但陰性對照中無熒光信號。在前期研究中發(fā)現(xiàn),黃海希瓦氏菌AP629菌落非常黏稠,電鏡下顯示菌株表面覆有一層黏稠的分泌物[4]。分析免疫熒光背景著色的原因,可能是多克隆抗體中的部分抗體針對的抗原決定簇位于菌體表面的分泌物上,在制備細菌懸液的過程中,部分黏附物從菌體表面脫落附著在載玻片上,進而使背景著色。用間接ELISA法檢測胞外產(chǎn)物,結果表明,黃海希瓦氏菌AP629胞外產(chǎn)物中確實含有與多克隆抗體相結合的抗原。

免疫印跡結果顯示,多克隆抗體與黃海希瓦氏菌AP629結合的抗原決定簇主要蛋白帶有6條,相對分子質量分別為131 000、128 000、113 000、62 000、38 000和33 000,其中38 000和33 000蛋白條帶的抗原性最強;與胞外產(chǎn)物結合的抗原決定簇清楚的蛋白條帶主要有3條,相對分子質量分別為62 000、38 000和33 000,其中62 000蛋白條帶信號最強。目前有關黃海希瓦氏菌AP629表面分泌物的組成及與菌株AP629致病性的關系仍不清楚,本研究結果雖然不能揭示AP629表面分泌物的蛋白組成,但據(jù)推測相對分子質量為62 000、38 000和33 000蛋白很有可能是分泌物中的蛋白組分,結果有待進一步研究。

[1] Brink A J,Van Straden A,Van Rensburg A J,et al.Shewanella (Pseudomonas)putrefaciens bacteremia[J].Clin Infect Dis,1995, 20:1327-1332.

[2] Butt A A,Figueroa J,Mart D H,et al.Ocular infection caused by three unusual marine organisms[J].Clin Infect Dis,1997,24(4): 740-744.

[3] 陳償,胡超群,陳曉燕,等.新發(fā)現(xiàn)的紅擬石首魚潰瘍病病原海藻施萬氏菌的分離和分子鑒定[J].海洋與湖沼,2003,34(1): 1-8.

[4] Li H,Qiao G,Li Q,et al.Biological characteristics and pathogenicity of a highly pathogenic Shewanella marisflavi infected sea cucumber(Apostichopus japonicus)[J].J Fish Dis,2010,33:865-877.

[5] Yoon J H,Yeo S H,Kim I G,et al.Shewanella marisflavi sp.nov. and Shewanella aquimarina sp.nov.,slightly halophilic organisms isolated from sea water of the Yellow Sea in Korea[J].Int J Syst Evol Micr,2004,54:2347-2352.

[6] Bharathkumar S,Rameshkumar N,Sudha N.16S rDNA gene sequence of Shewanella marisflavi isolated from rhizosphere soil of Porteresia coarctata[EB/OL].[2010-09-01]http://www.ncbi. nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=110227154 (unpublished).

[7] Inamura H,Muroga K,Nakai T.Toxicity of extracellular products of V.anguillarum[J].Fish Pathol,1984,19(2):89-96.

[8] 楊嘉龍,周麗,邢婧,等.養(yǎng)殖刺參潰瘍病殺鮭氣單胞菌的分離、致病性及胞外產(chǎn)物特性分析[J].中國水產(chǎn)科學,2007,14 (6):981-989.

[9] 李建武,蕭能慶,余瑞元,等.生物化學實驗原理和方法[M].北京:北京大學出版社,1994.

[10] Li Q,Li Y,Li H,et al.Production characterization and application of monoclonal antibody to spherulocytes:A subpopulation of coelomocytes of Apostichopus japonicus[J].Fish&Shellfish Immun, 2010,29:832-838.

[11] 張春云,王印庚,榮小軍.養(yǎng)殖刺參腐皮綜合征病原菌的分離與鑒定[J].水產(chǎn)學報,2006,30(1):118-123.

[12]馬悅欣,徐高蓉,常亞青,等.大連地區(qū)刺參幼參潰爛病細菌性病原的初步研究[J].大連水產(chǎn)學院學報,2006,21(1):13-18.

[13] 謝建軍,王印庚,張正,等.養(yǎng)殖刺參腐皮綜合征兩種致病菌Dot-ELISA快速檢測[J].海洋科學,2007,31(8):59-64.

[14] 白方方,蘭建新,王燕,等.遲緩愛德華氏菌間接ELISA快速檢測法[J].中國水產(chǎn)科學,2009,16(4):619-625.

[15] 黃志堅,何建國.溶藻弧菌菌體及其外膜蛋白多克隆抗體的研究[J].中山大學學報:自然科學版,2006,45(3):78-81.

Partial characterization of polyclonal antibody against bacterium Shewanella marisflavi

LI Qiang,QI Nan,YANG Li-wen,LI Hua,WANG Yi-nan
(Key Laboratory of Mariculture,Agriculture Ministry,PRC,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

High titer polyclonal antibody(pAb)against bacterium Shewanella marisflavi isolated AP629,a novel pathogen of sea cucumber Apostichopus japonicus,was produced from New Zealand white rabbit with the inactivated vaccine,and partial characterization of the pAb was analyzed with indirect enzyme-lined immunosorbent assay,immunofluorescence assay and western blot.The results showed that the titer of the pAb was 1∶32 768.There was strong reaction of pAb against strain AP629 with S.marisflavi(KCCM 41822),weak or none that with vibrio,Aeromonas salmonicida,Streptococcus iniae,and Escherichia coli.The binding antigens of pAb was located not only in the membrane of the cells but also secretion on the surface of strain AP629.Under reducing conditions in western blotting,the major antigenic determinants of the strain AP629 were 131 000,128 000,113 000,62 000,38 000 and 33 000,respectively,in which the 38 000 and 33 000 had stronger signals than the others did.In addition,three major protein antigens of ECP from strain AP629 in molecular weights of 62000,38000 and 33 000 were recognized in western-blot using above pAb,especially protein of 62 000.

Apostichopus japonicus;Shewanella marisflavi;polyclonal antibody

S917.1

A

2095-1388(2011)04-0376-05

2010-09-23

國家自然科學基金資助項目(30800853);國家“十一五”科技支撐計劃項目(2006BAD09A01);國家專項(908-01-ZH3);遼寧省海洋與漁業(yè)廳項目(201005)

李強(1979-),男,博士,副教授。E-mail:liqiang@dlou.edu.cn

李華(1958-),女,教授。E-mail:lihua@dlou.edu.cn