林飛燕,陸 春

(中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚病與性病科,廣東廣州 510630)

生物被膜(Biofilm,BF)是微生物在生長過程中附著于物體表面而形成的由微生物的細(xì)胞及其分泌的聚合物等所組成的膜樣多細(xì)胞復(fù)合體,多項(xiàng)研究表明生物被膜的形成可以增強(qiáng)微生物對(duì)環(huán)境和抗生素的耐受性,目前生物被膜的形成被認(rèn)為是微生物耐藥尤其是多重耐藥的機(jī)制之一[1]。在耐藥機(jī)制的研究中,微生物的耐藥性通常由某耐藥基因或基因突變的編碼產(chǎn)物所介導(dǎo),相對(duì)而言生物被膜形成介導(dǎo)的耐藥機(jī)制則十分復(fù)雜。目前研究發(fā)現(xiàn),耐藥基因尤其是藥物外排泵編碼基因和生物被膜在微生物耐藥機(jī)制中有著復(fù)雜而密切的關(guān)系:生物被膜初步開始形成后,菌株基因表達(dá)即開始發(fā)生變化以適應(yīng)新的生長環(huán)境,這種變化由獨(dú)特的基因表達(dá)模式所控制,稱為生物被膜表型,生物被膜內(nèi)環(huán)境對(duì)多種基因表型具有特殊的調(diào)控作用;在生物被膜形成過程中,某些耐藥基因及其產(chǎn)物可能在影響生物被膜形成、增強(qiáng)生物被膜耐藥性、協(xié)助生物被膜內(nèi)部信號(hào)傳導(dǎo)以及調(diào)控生物被膜毒力、活性等多方面發(fā)揮不同作用。本文分別從生物被膜對(duì)藥物外排泵、耐藥基因的影響,藥物外排泵對(duì)生物被膜的影響,以及藥物外排泵和微生物生物被膜共同的調(diào)節(jié)因素等方面,對(duì)近年來的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 生物被膜對(duì)藥物外排泵、耐藥基因的影響

1.1 生物被膜的內(nèi)環(huán)境特點(diǎn)及其與藥物外排泵的關(guān)系

生物被膜中的營養(yǎng)成分和氧濃度自外向內(nèi)呈梯度下降,代謝產(chǎn)物濃度、滲透壓則逐漸上升,生長環(huán)境的差異使生物被膜外層與內(nèi)層微生物體積大小和代謝活性存在顯著差異,內(nèi)層的微生物生長狀態(tài)較外層微生物緩慢也稱饑餓狀態(tài);目前大多數(shù)抗生素均是針對(duì)生長期的微生物,當(dāng)使用抗菌藥物治療時(shí),生長快速的生物被膜外層或表層微生物最敏感,首先被殺死,而大多數(shù)抗生素都不能很好地殺滅生長緩慢或停滯的處于饑餓狀態(tài)的微生物,這是生物被膜耐受抗菌藥物和持續(xù)存在的重要機(jī)制之一[1]。也有研究指出生物膜菌株和游離菌株即使生長速度相同,耐藥水平依然差異很大:銅綠假單胞菌的游離株和膜內(nèi)株對(duì)妥布霉素和環(huán)丙沙星的敏感性隨生長速度的加快而增加,但在較高的生長速度下,浮游菌比膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)環(huán)丙沙星更敏感[2]。與此同時(shí),生物被膜深層微生物累積的高濃度代謝產(chǎn)物還可以增強(qiáng)外排泵的作用,如大腸埃希菌生物被膜中的代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)AcrAB-TolC外排泵對(duì)萘啶酮酸泵出作用增強(qiáng),而某些藥物外排泵(主要為多藥耐藥外排泵)不僅僅以抗菌藥物為底物,還可以將微生物的代謝產(chǎn)物、毒性物質(zhì)、酶類、致病因子等排出胞外,這可能有助于生物被膜內(nèi)饑餓狀態(tài)微生物維持其活力與毒力[3]。

1.2 生物被膜中耐藥基因的表達(dá)及對(duì)耐藥性的影響

目前對(duì)生物被膜中相關(guān)耐藥基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平的定量監(jiān)測(cè),是生物被膜耐藥機(jī)制研究的一大熱點(diǎn)。在生物被膜形成過程中,耐藥基因表達(dá)的上調(diào)有助于生物被膜對(duì)抗菌藥物抵抗力的增強(qiáng),其中排泵基因的影響最為顯著:在白色念珠菌生物被膜形成過程中,表面可結(jié)合氮雜茂的受體數(shù)目與懸浮生長時(shí)相近,但氮雜茂外排泵的編碼基因CDR的表達(dá)水平比懸浮生長時(shí)上調(diào),提示外排泵基因的高度表達(dá)對(duì)白色念珠菌生物被膜的抗藥性產(chǎn)生有一定作用[4]。在銅綠假單胞菌生物被膜的耐藥機(jī)制中,有研究證實(shí)其對(duì)阿奇霉素和對(duì)妥布霉素的耐藥性分別是由MexCD-OprJ外排泵和MexXY-Op rM外排泵高表達(dá)所致[5-6],而PA1874-1877編碼的外排系統(tǒng)對(duì)于銅綠假單胞菌生物被膜多重耐藥(耐受妥布霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星)具有重要作用[7]。但耐藥基因高表達(dá)并不意味著耐藥性必然升高,有研究發(fā)現(xiàn)盡管銅綠假單胞菌生物被膜中MexAB-Op rM外排系統(tǒng)也存在過度表達(dá),卻并未對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素顯示出耐藥性增強(qiáng)[8]。生物被膜耐藥性對(duì)藥物外排泵的依賴性并非始終如一,如銅綠假單胞菌生物被膜MexAB-Op rM基因的表達(dá)水平,只能影響其對(duì)低劑量氧氟沙星的耐藥性[9]。另外,耐藥基因在生物被膜形成的不同時(shí)期其表達(dá)水平也并不一致:白假絲酵母菌生物被膜的成熟程度與耐藥性增強(qiáng)有明顯正相關(guān)性,有研究發(fā)現(xiàn)外排泵編碼基因CDR1、CDR2和MDR1在白念珠菌生物被膜形成的早期(<12 h)表達(dá)增多,可能參與耐藥,但在成熟期(>12 h)以上3種基因缺失的菌株也達(dá)到了與攜帶耐藥基因的菌株相同的耐藥水平[10];也有研究指出,與早期生物被膜相比,白色念珠菌成熟生物被膜菌株的藥物流出泵基因CDR1表達(dá)上調(diào),表達(dá)水平改變活躍,而MDR1基因的表達(dá)在生物被膜的整個(gè)成熟過程中基本維持不變[11]。此外,耐藥基因表達(dá)并非一味增強(qiáng),出現(xiàn)上調(diào)或下降均有可能,有研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的某突變體雖然可以形成正常的生物被膜結(jié)構(gòu),但形成過程中包括編碼多藥外排泵的wasyhcQ基因在內(nèi)的22種基因均出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)[12]。

1.3 生物被膜中的基因突變和表型改變

生物被膜內(nèi)微生物突變頻率明顯高于浮游狀態(tài)的微生物,這意味著高突變微生物亞群的存在,突變結(jié)果對(duì)生物被膜中微生物的耐藥性、黏附力、致病力等多種生物學(xué)特性的增強(qiáng)具有重要作用[13],例如銅綠假單胞菌菌株對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性被證明是由gyrA基因和2個(gè)外排系統(tǒng)(Mex-CD-OprJ和MexEF-Opr N)的突變導(dǎo)致[14];表皮葡萄球菌的luxS突變株形成生物被膜的能力增強(qiáng),且在大鼠模型中生物被膜感染加重[15]。生物被膜中氧化壓力的不平衡導(dǎo)致微生物出現(xiàn)氧化應(yīng)激,被認(rèn)為是引起生物被膜內(nèi)基因突變的重要原因[16]。生物被膜形成后某些基因可出現(xiàn)明顯的表型改變,從mRNA水平和蛋白水平都和游離狀態(tài)的微生物存在很大區(qū)別,如大腸埃希菌生物被膜有10%基因表達(dá)明顯不同于浮游細(xì)菌,其中1.9%基因表達(dá)活性上調(diào)或下調(diào)2倍以上[17]。

1.4 生物被膜促進(jìn)細(xì)菌間耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移

由于生物被膜內(nèi)微生物彼此密切接觸,菌體間基因的水平轉(zhuǎn)移更加容易,整合酶的整合功能更活躍,整合子在生物被膜狀態(tài)下也可進(jìn)行更活躍的基因捕獲[18],因而生物被膜內(nèi)微生物基因和表型更容易復(fù)雜化和多樣化,更易導(dǎo)致微生物出現(xiàn)高度多重耐藥性。有人從腎病患者尿管上的混合微生物生物被膜中分離出高度耐受萬古霉素的金黃色葡萄球菌,該菌同時(shí)耐受耐氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素、四環(huán)素等多種抗菌藥物,PCR分析該菌的耐藥基因,發(fā)現(xiàn)該菌攜帶有由多種耐藥基因組合而成的多重耐藥基因簇,包括四環(huán)素耐藥基因tet基因,er mB-aadE-sat4-aphA-3,大環(huán)內(nèi)酯類外排泵基因m srA基因,以及氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-aph(2′′)-Ia等,該研究認(rèn)為混合微生物生物被膜中細(xì)菌之間的密切接觸為外源耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移提供了便利,同時(shí)生物被膜微環(huán)境增強(qiáng)了這些耐藥基因的作用[19]。

1.5 QS系統(tǒng)對(duì)外排泵的影響

QS系統(tǒng)(quorum-sensing,群體感應(yīng)系統(tǒng))是一種微生物間信息傳遞機(jī)制,微生物通過互相傳遞一種胞外自誘導(dǎo)分子(autoinducer,A I)的濃度來控制整個(gè)微生物群體的行為。當(dāng)A I的濃度隨著微生物群體的密度不斷升高并達(dá)到一定閾值時(shí),就會(huì)滲透到細(xì)胞內(nèi)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合,形成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白-信號(hào)分子聚合物,此聚合物能夠結(jié)合到特定的DNA序列上,啟動(dòng)靶基因表達(dá)。QS系統(tǒng)能夠使原本互相獨(dú)立的單個(gè)游離的微生物統(tǒng)一步伐,群集性地對(duì)外界刺激做出反應(yīng),顯示出單個(gè)微生物所不具有的生理功能和生態(tài)特征,能夠有力的增強(qiáng)微生物群體的生存能力[1]。QS系統(tǒng)參與微生物很多生物學(xué)功能的調(diào)控如:細(xì)菌聚集性、游動(dòng)性、生物被膜形成,微生物抗生素合成,毒性因子表達(dá),表面活性物質(zhì)產(chǎn)生,胞外酶產(chǎn)生,質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移等[20]。同時(shí),QS系統(tǒng)還參與影響耐藥基因表達(dá)和微生物的耐藥性,如脆弱類擬桿菌的LuxR I系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)bmeB外排泵的表達(dá)[21],表皮葡萄球菌QS系統(tǒng)中的agrD和RNAⅢ參與介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)紅霉素的耐藥性增加[22]。

2 藥物外排泵對(duì)生物被膜的影響

2.1 外排泵參與生物被膜及QS系統(tǒng)的形成

微生物形成生物被膜是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,包括微生物的初始黏附,微生物的表面錨定,微生物繁殖、聚集成微小菌落,形成復(fù)雜的蘑菇狀成熟生物被膜,生物被膜內(nèi)微生物的分離[23]。最近發(fā)現(xiàn)外排泵可以輔助細(xì)胞間的信號(hào)分子傳導(dǎo),協(xié)助生物被膜形成QS系統(tǒng):類鼻疽假單胞菌的BpeABOpr B外排泵是一個(gè)誘導(dǎo)外排系統(tǒng),bpeR是類鼻疽假單胞菌生物被膜產(chǎn)生的A I中的一種,研究發(fā)現(xiàn)BpeAB-Opr B外排泵是合成bpeR所必需的,其功能影響了自誘導(dǎo)分子合酶BpsI的表達(dá)[24]。需要注意的是,外排泵的存在并不總是有利于微生物生物被膜,有研究發(fā)現(xiàn)SmeDEF外排泵過表達(dá)造成微生物營養(yǎng)的損耗,由此抑制了微生物生長和毒力[3]。

2.2 藥物外排泵和生物被膜外基質(zhì)對(duì)抗菌藥物的抵御作用

生物被膜外的基質(zhì)成分可以減慢或阻止抗生素滲透到生物被膜中,例如氟喹諾酮類抗菌藥物可以緩慢滲透入生物被膜的胞外基質(zhì),且因其在基質(zhì)中濃度過低不能有效發(fā)揮作用,還易誘發(fā)β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)而被水解[1],這類機(jī)制可能取決于基質(zhì)中多糖物質(zhì)的黏附、正負(fù)電荷的吸附、抗菌素滅活酶的鈍化作用[25]以及迂曲的滲透途徑[26]。但有些藥物雖能通過外基質(zhì)但仍無療效,例如氟化喹啉可以輕易穿透大部分微生物生物被膜,氨芐青霉素也可以穿透缺乏β-內(nèi)酰胺酶的肺炎桿菌生物被膜,但生物被膜深層的微生物并不能被清除,這可能得益于藥物外排泵的表達(dá)上調(diào),協(xié)助微生物將滲透入生物被膜的抗菌藥物排出細(xì)胞外,銅綠假單胞菌的MexAB-Op rM和MexCDOprJ外排泵已被證明是介導(dǎo)生物被膜耐藥特別是對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類阿奇霉耐藥的具體機(jī)制[27]。

2.3 抵抗免疫清除

在宿主體內(nèi),生物被膜中大量的黏性基質(zhì)包裹著微生物,形成了一個(gè)物理屏障,可以將微生物和機(jī)體免疫系統(tǒng)隔開,使機(jī)體的吞噬細(xì)胞和殺傷細(xì)胞及其所分泌的酶不能對(duì)微生物產(chǎn)生有效的攻擊;生物被膜還可以調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、抵御免疫細(xì)胞的吞噬調(diào)理作用,如銅綠假單胞細(xì)菌生物被膜可增加γ干擾素分泌從而抑制白細(xì)胞吞噬作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)藥物外排泵也可參與微生物對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的作用,如在桿狀細(xì)菌李斯特菌中,MdrL、Md rM、MdrT外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可影響宿主的免疫應(yīng)答,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素的合成,這種作用可能是由于外排泵釋放了與宿主細(xì)胞因子相似或接近的物質(zhì)分子干擾所致[29]。

3 對(duì)藥物外排泵和微生物生物被膜同時(shí)有調(diào)控作用的物質(zhì)

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些物質(zhì)可對(duì)微生物生物被膜和藥物外排泵同時(shí)具有調(diào)節(jié)作用:四環(huán)素可同時(shí)促進(jìn)白色念珠菌生物被膜形成和外排泵表達(dá),在培養(yǎng)生物被膜同時(shí)加入一定濃度的四環(huán)素,可通過增加菌絲出芽對(duì)白色念珠菌生物被膜的形成有輕度促進(jìn)作用,同時(shí)上調(diào)了CDR1外排泵的表達(dá)[30];脆弱類擬桿菌如暴露于0.15%膽汁鹽或非結(jié)合型膽汁鹽中,可增加RND型外排泵編碼基因和主要外膜蛋白OmpA的表達(dá),并表現(xiàn)出微生物聚集性、對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附力和生物被膜形成均顯著增加[31]。有研究發(fā)現(xiàn)添加外排泵抑制劑如甲硫達(dá)嗪、β-鹽酸苯甲酰精氨酰萘胺(PAβN)或1-(1-萘甲基)哌嗪,可以減弱相對(duì)應(yīng)的外排泵的功能,抑制大腸埃希菌的生物被膜形成,并增強(qiáng)抗菌藥物的殺菌作用[32];而外排泵抑制劑PAβN和鐵螯合劑(如2,2′-聯(lián)吡啶,乙酰氧肟酸,乙二胺四乙酸即EDTA等)聯(lián)合作用,可以抑制銅綠假單胞菌細(xì)菌生長和生物膜的形成[33]。

4 展 望

綜上所述,藥物外排泵和微生物生物被膜在微生物耐藥機(jī)制中扮演著密切相關(guān)的重要角色:微生物生物被膜形成后常導(dǎo)致微生物耐藥性增強(qiáng)、多重耐藥性,并常增強(qiáng)微生物對(duì)環(huán)境的抵抗力,使之難以清除而導(dǎo)致臨床相關(guān)感染的難治性,而藥物外排泵的存在又對(duì)生物被膜的生長、耐藥性等具有促進(jìn)增強(qiáng)作用,二者共存使常規(guī)抗菌藥物的療效面臨著嚴(yán)峻考驗(yàn)。目前,迫切需要合適的藥物對(duì)微生物生物膜這一特點(diǎn)進(jìn)行有效治療。像外排泵抑制劑這樣能同時(shí)抑制藥物外排泵活性和生物被膜生長的藥物或化學(xué)成分,能夠更有力地清除微生物生物被膜,削弱藥物外排泵的作用,降低微生物抗藥性,對(duì)生物膜感染所致的臨床疾病具有更大的治療潛力。

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