劉 蕾,劉艷霞,鄧 渝,劉俊康

(中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué),重慶 400038)

人類正面臨著內(nèi)、外環(huán)境的挑戰(zhàn),微生態(tài)環(huán)境作為一種重要的內(nèi)環(huán)境對(duì)人體健康影響巨大。生命活動(dòng)的本質(zhì)是生物與內(nèi)外環(huán)境形成的生態(tài)系統(tǒng)的平衡過程,而疾病多由各種干擾宿主的因素過度作用導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)引起。奇異變形桿菌(Proteus m irabilis,PM)是一種重要的致病菌,有遷徙生長現(xiàn)象,研究表明變形桿菌群集運(yùn)動(dòng)能力有助于其在泌尿道的定植[1],其分化成鞭毛密度較大的群集體細(xì)胞后,能促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的入侵能力[2],而環(huán)境因素的變化會(huì)影響細(xì)菌的生長增殖、菌體形態(tài)及鞭毛密度等,從而引起細(xì)菌侵襲能力的變化。本研究以奇異變形桿菌為對(duì)象,以呼吸酶活性指示劑2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)為指示,觀察細(xì)菌生長速度及遷徙能力的變化情況,并通過革蘭染色和鞭毛染色觀察菌體形態(tài)和鞭毛形態(tài)的變化情況,揭示同株奇異變形桿菌存在不同的生長狀態(tài),可能是細(xì)菌對(duì)環(huán)境變化表現(xiàn)出的適應(yīng)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 奇異變形桿菌(Proteus m irabilis,PM)由第三軍醫(yī)大學(xué)生物波實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 LB指示培養(yǎng)基 胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,各成分溶于蒸餾水,調(diào)pH至7.2～7.4,加入1.5%瓊脂,高壓滅菌,臨用前加入TTC溶液(10%TTC◇0.4 mol/L琥珀酸鈉◇生理鹽水為1◇5◇4,過濾除菌)使終濃度為0.05%及0.1%葡萄糖,制成平板。

1.1.3 儀器 顯微鏡型號(hào):OLY MPUS BX41;圖像采集系統(tǒng):OLY MPUS DP72 CCD;圖像分析軟件:DP2-BS W-E-V2.2。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌接種 用無菌塑料環(huán)均勻蘸取奇異變形桿菌菌液,環(huán)形接種于LB指示培養(yǎng)基平板上,37℃恒溫培養(yǎng)。待環(huán)形接種的奇異變形桿菌向環(huán)內(nèi)及環(huán)外生長速度減慢且出現(xiàn)扇狀面凸起時(shí),用接種針分別取不同區(qū)域細(xì)菌點(diǎn)種于LB指示培養(yǎng)基平板上,由外至內(nèi)分別標(biāo)記為A、B和C,37℃恒溫培養(yǎng)過夜,觀察細(xì)菌生長速度、菌體形態(tài)及鞭毛形態(tài)。將第1次點(diǎn)種傳代的細(xì)菌按照上述方法繼續(xù)傳代,依次標(biāo)記為第2代、第3代等,觀察各代之間細(xì)菌生長速度、菌體形態(tài)及鞭毛形態(tài)的變化情況。

1.2.2 革蘭染色 取第4代奇異變形桿菌A、B和C生長環(huán)上最外沿的菌體涂片固定,草酸銨結(jié)晶紫染色1 min,自來水沖洗,加碘液覆蓋涂面染色1 min,水洗,吸水紙吸去多余水分,加95%酒精數(shù)滴,輕輕搖動(dòng)脫色,30 s后水洗,吸去多余水分,蕃紅染色液(稀)染色10 s后,自來水沖洗,干燥,油鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照記錄。

1.2.3 鞭毛染色—改良Ryu法 取第4代奇異變形桿菌A、B和C生長環(huán)上最外沿的菌體,按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]方法進(jìn)行鞭毛染色,油鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 同株奇異變形桿菌出現(xiàn)不同生長狀態(tài)

環(huán)形接種于LB指示培養(yǎng)基平板上的奇異變形桿菌,37℃恒溫培養(yǎng)24 h后向環(huán)內(nèi)及環(huán)外生長的速度減慢,44 h后向環(huán)內(nèi)及環(huán)外均出現(xiàn)扇狀面凸起,箭頭標(biāo)記處(圖1)。用接種針分別蘸取環(huán)外凸起、環(huán)上及環(huán)內(nèi)凸起區(qū)域的細(xì)菌點(diǎn)種于LB指示培養(yǎng)基平板上,依次標(biāo)記為A、B和C,37℃恒溫培養(yǎng)過夜,觀察發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域細(xì)菌生長速度及遷徙能力出現(xiàn)了明顯差異,環(huán)上細(xì)菌生長環(huán)數(shù)最少且環(huán)間距最小,外環(huán)凸起的細(xì)菌生長環(huán)數(shù)及環(huán)間距次之,內(nèi)環(huán)凸起的細(xì)菌生長環(huán)數(shù)最多且環(huán)間距最大(圖2)。用接種針蘸取第1次點(diǎn)種傳代細(xì)菌的A、B和C環(huán)外沿菌體,點(diǎn)種于LB指示培養(yǎng)基平板上繼續(xù)傳代,依次標(biāo)記為第2代、第3代,直至第7代仍發(fā)現(xiàn)A、B和C環(huán)細(xì)菌生長速度及遷徙能力具有明顯差異,且變化趨勢(shì)與第1代細(xì)菌保持一致(圖3),提示同株奇異變形桿菌生長速度及遷徙能力發(fā)生了變化,且這種變化可傳遞多代。

圖1 環(huán)形接種44 h觀察結(jié)果Fig.1 44 h after annular inoculation

圖2 第1次點(diǎn)種傳代不同區(qū)域細(xì)菌生長情況Fig.2 bacterium growth state in different regions after the first dibbling passage

2.2 不同區(qū)域細(xì)菌革蘭染色結(jié)果

以第4代細(xì)菌為例,取A、B和C環(huán)外沿菌體進(jìn)行革蘭染色,觀察發(fā)現(xiàn)A和C菌體多為長桿狀或絲狀體,其中C菌體比A略粗,而B菌體多為短桿狀(圖4)。

2.3 不同區(qū)域細(xì)菌鞭毛染色結(jié)果

以第4代細(xì)菌為例,取A、B和C環(huán)外沿菌體進(jìn)行鞭毛染色,觀察發(fā)現(xiàn)C菌體鞭毛數(shù)量最多且鞭毛形態(tài)較長,A菌體鞭毛數(shù)量和長度次之,B菌體鞭毛數(shù)量較少且鞭毛形態(tài)較短(圖5)。

圖3 點(diǎn)種傳代第2～7代不同區(qū)域細(xì)菌生長情況Fig.3 bacterium growth state in different regions of the second to the seventh generation by dibbling passage

圖4 第4代細(xì)菌不同區(qū)域菌體革蘭染色情況(1 000×)Fig.4 Gram stain of bacterium in different regions of the fourth generation(1 000×)

圖5 第4代細(xì)菌不同區(qū)域菌體鞭毛染色情況(1 000×)Fig.5 Flagellum stain of bacterium in different regions of the fourth generation(1 000×)

3 討 論

本研究室前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),改變培養(yǎng)環(huán)境可影響奇異變形桿菌的集群生長模式,能快速、直觀地反應(yīng)環(huán)境對(duì)微生態(tài)系統(tǒng)的影響[2]。Howard C.Berg[4]研究發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌在營養(yǎng)豐富的軟瓊脂表面菌體延長,鞭毛增多,而當(dāng)瓊脂表面干燥時(shí),菌體鞭毛縮短。本研究中奇異變形桿菌培養(yǎng)44 h后,同株細(xì)菌的群運(yùn)動(dòng)模式、菌體形態(tài)、鞭毛數(shù)量及鞭毛形態(tài)均發(fā)生了變化,可能是因?yàn)殚L時(shí)間培養(yǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基水分、營養(yǎng)物質(zhì)等含量發(fā)生了變化,從而誘變出不同生長狀態(tài)的細(xì)菌,這種培養(yǎng)環(huán)境的變化起初抑制細(xì)菌的集群運(yùn)動(dòng),長時(shí)間抑制又可誘變出遷移能力增強(qiáng)、菌體增長、鞭毛增多的菌體,誘變后的細(xì)菌在多次傳代過程中仍能保持上述變化特性,提示環(huán)境因素變化可能使細(xì)菌產(chǎn)生可遺傳的突變,對(duì)細(xì)菌的生長、增殖及侵襲能力有巨大的影響。但導(dǎo)致同株細(xì)菌出現(xiàn)不同生長狀態(tài)的具體環(huán)境因素,如濕度、營養(yǎng)條件等因素還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證明。

有研究報(bào)道微生物形態(tài)變化,如形成絲狀體,是微生物自我保護(hù)、趨利避害、適應(yīng)環(huán)境的一種體現(xiàn)。本研究中革蘭染色發(fā)現(xiàn)遷徙生長較快的A環(huán)和C環(huán)細(xì)菌菌體增長,而遷徙生長最慢的B環(huán)細(xì)菌菌體多為短桿狀,其中遷徙生長速度最快的C環(huán)細(xì)菌菌體最粗,提示細(xì)菌生長增殖活力與菌體形態(tài)密切相關(guān),可能是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境生長的一種表現(xiàn)形式。鞭毛染色觀察發(fā)現(xiàn),鞭毛數(shù)量、長度與細(xì)菌的遷徙速率呈正相關(guān),提示細(xì)菌生長增殖活力還與鞭毛的數(shù)量和形態(tài)密切相關(guān)。由于奇異變形桿菌鞭毛形態(tài)和遷徙能力可直接影響其對(duì)宿主的侵襲能力,因此推測(cè)環(huán)境誘變后的奇異變形桿菌的耐藥性也可能發(fā)生變化,但仍需要相關(guān)后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1] Kim DJ,Boylan B,George N,et al.Inactivation of ompR promotes precocious swarming and flhDC expression in Xenorhabdus nematophila[J].J Bacteriol,2003,185(17):5290-5294.

[2] 賈雄飛,劉俊康,徐啟旺.奇異變形桿菌周期性群集運(yùn)動(dòng)的研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(9):868-870.

[3] 葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版)[M].南京:東南大學(xué)出版社,2006:727.

[4] Berg HC.Swarming motility:it better be wet[J].Curr Biol,2005,15(15):R599-600.