季愛加,寧喜斌

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是由日本學(xué)者下村修[1]于1962年從多管水母(Aequorea victoria)中發(fā)現(xiàn)并分離得到的一種發(fā)光蛋白。分子質(zhì)量為26 ku,是由238個氨基酸構(gòu)成的“β-桶”型三維立體結(jié)構(gòu),其中第65～67位氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)形成發(fā)光團(tuán),為主要發(fā)光的位置。GFP的結(jié)構(gòu)賦予了其一些獨特的性質(zhì)[2]:熒光穩(wěn)定、檢測方便、無種屬特異性、不需任何反應(yīng)底物和輔助因子、易于構(gòu)建載體,并且它不會破壞細(xì)胞生長環(huán)境,對細(xì)胞生理功能無影響等,因此是常用的報告基因。目前,科研人員根據(jù)不同需要,利用氨基酸序列修飾等方法對GFP進(jìn)行改進(jìn),獲得了一系列優(yōu)良的變異體,發(fā)光的強度和顏色都有變化,如苯丙氨酸64被亮氨酸取代,絲氨酸65被蘇氨酸取代的EGFP熒光強度就增加了35倍。而且出現(xiàn)了紅色、黃綠色、藍(lán)色等多種顏色的熒光蛋白,大大拓寬了GFP研究的領(lǐng)域[3]。近些年,國內(nèi)外掀起了關(guān)于GFP研究的熱潮,已見GFP應(yīng)用于各人源細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌等領(lǐng)域中[4-7]。本研究以原核生物E.coliBL21為表達(dá)宿主,利用PCR技術(shù)從模板EGFP-N3中克隆得到EGFP片段,并在其2端引入酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ,對引入酶切位點的EGFP片段和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切處理,連接后得到重組質(zhì)粒pET28a-EGFP并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,通過IPTG誘導(dǎo)可以高效表達(dá)。食品安全問題一直是困擾各國的公共衛(wèi)生問題,食源性病原菌又是引起食品安全問題的主要因素之一。通過本研究,期望能夠為以后EGFP作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記食源性病原菌,跟蹤監(jiān)測病原菌的侵染路徑提供理論基礎(chǔ),從而為食品安全風(fēng)險評估等提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料與試劑 PEGFP-N3模板、菌株E.coliDH5α(用于質(zhì)粒的保存)、E.coliBL21(用于重組質(zhì)粒的表達(dá))、質(zhì)粒pET28a(復(fù)旦大學(xué)遺傳所);限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ,HindⅢ(紐英倫生物技術(shù)有限公司);T4DNA連接酶、1 kb DNA ladder(Fermentas公司);DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒(愛思進(jìn)生物技術(shù)公司);DNA純化試劑盒及IPTG(大連寶生物工程有限公司);PCR用試劑(北京全式金生物技術(shù)公司);卡那霉素、瓊脂糖及PCR合成引物等(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);蛋白胨、酵母浸出粉、瓊脂粉等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備 PTC-200 PCR儀(美國Bio-Rad公司);GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);Carl Zeiss Axio-Scope.A1落射熒光顯微鏡(德國Zeiss Jena);DYY-6C電泳槽和電泳儀(北京六一儀器廠);TGL-16G高速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);UV2300紫外可見分光光度計(上海天美科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 EGFP基因的PCR擴增和回收 以PEGFP-N3中EGFP片段為模板,設(shè)計上游引物:5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′,下游引物:5′-GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3′。分別取4.0 μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0 μLTransStart FastPfuDNA polymerase(5 U/μL)、10μL 10×Buffer、5.0μL dNTPMixture作為PCR反應(yīng)體系。用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至50μL,于95℃條件下預(yù)變性處理2 min,然后分別在94℃變性20 s、65℃退火20 s、72℃延伸30 s、最終72℃終延伸5 min,整個PCR反應(yīng)體系共進(jìn)行35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗證后,用DNA純化試劑盒回收后待用。

1.2.2 EGFP基因和pET28a表達(dá)載體的限制性酶切處理 取上述經(jīng)DNA純化試劑盒純化后的目的片段作為PCR反應(yīng)的模板,設(shè)計引入EcoRⅠ酶切位點的上游引物(5′-GGAG/AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′)和引入HindⅢ酶切位點的下游引物(5′-CCGA/AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC-3′)。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同1.2.1。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,進(jìn)行DNA純化。純化后的EGFP片段進(jìn)行雙酶切[8],反應(yīng)體系如下:30 μL添加了酶切位點的EGFP片段、5μL 10×buffer2、1μLEcoRⅠ(20 U/μL)、1μLHindⅢ(20 U/μL),用無菌水將反應(yīng)液調(diào)至50μL后,于37℃下保溫1 h,然后在65℃條件下處理20 min進(jìn)行熱失活。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,DNA純化試劑盒純化回收。另一方面,將pET28a質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,切下線性質(zhì)粒條帶進(jìn)行純化回收。

1.2.3 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將上述含酶切位點的EGFP片段與線性pET28a質(zhì)粒按2◇1比例、在45℃下保溫5 min后,置于冰浴中冷卻,冷卻后分別加入1μL T4DNA連接酶、2μL 10×T4DNA連接酶緩沖液,16℃保溫16 h,如圖1所示。連接液轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后,挑選3～5個菌落做PCR驗證,進(jìn)一步進(jìn)行酶切鑒定,陽性克隆用于DNA測序。對經(jīng)測序確證的、含pET28a-EGFP重組質(zhì)粒的菌落進(jìn)行質(zhì)粒提純。

圖1 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction of recombinant expression vector pET28a-EGFP

1.2.4 EGFP基因的原核表達(dá)及檢測 取1μL“pET28a-EGFP”重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜后。隨機挑選10個陽性菌落克隆于含卡那霉素(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)液中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)至OD600=0.4時,加入誘導(dǎo)劑IPTG,并使其終濃度為1.0 mmol/L。將含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液于25℃、110 r/min條件培養(yǎng)12 h后,制成玻片于熒光顯微鏡下觀察,對在熒光顯微鏡下發(fā)綠光的大腸埃希菌及時保種,同時,劃線至含卡那霉素(50 μg/mL)及IPTG(1 mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)12 h,觀察菌落形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-EGFP重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將EGFP片段與pET28a表達(dá)載體經(jīng)連接液連接后,通過對挑取的單菌落做菌落PCR檢驗,如圖2所示,PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,發(fā)現(xiàn)在約750 bp處有清晰條帶(圖2左),與理論相符,初步確定為陽性克隆。進(jìn)一步對陽性菌落中的質(zhì)粒進(jìn)行提純、用EcoRⅠ和HindⅢ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,可在約750 bp處看到目的片段的條帶(圖2右)。最終將PCR產(chǎn)物送往上海美吉生物技術(shù)公司進(jìn)行測序,通過與GenBank序列比對,結(jié)果顯示序列匹配率為100%,由此可以證明目的片段“EGFP”已正確連接到pET28a表達(dá)載體,并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。

2.2 重組表達(dá)載體pET28a-EGFP在E.coli BL21中的表達(dá)與檢測

盡管目的片段EGFP與表達(dá)載體pET28a得到了有效重組,但重組載體pET28a-EGFP是否能在原核系統(tǒng)中得到高效表達(dá)還需進(jìn)一步研究,因此通過利用pET28a-EGFP轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行檢測。在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中篩選陽性克隆,LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)至OD600=0.4時,加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)12 h,取少量菌液涂片,在熒光顯微鏡(10×100)下可以明顯觀察到發(fā)綠光的單個細(xì)菌,將轉(zhuǎn)化成功的E.coliBL21命名為E.coliBL21-1,如圖3所示。而轉(zhuǎn)化菌劃線于含卡那霉素(50μg/mL)與IPTG(1 mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,在自然光下菌落呈綠色如圖4所示,因此可以說明,重組表達(dá)載體pET28a-EGFP能夠在原核系統(tǒng)中得到高效的表達(dá),并且表達(dá)效果較好。

圖2 重組質(zhì)粒的PCR插入檢驗(左)和雙酶切鑒定(右)Fig.2 Identification of recombinant plasmid by PCR amplification(left)and digesting with restriction enzymes(right)

圖3 E.coliBL21-1在藍(lán)光激發(fā)下(左)和在自然光下(右)觀察的結(jié)果Fig.3 Expression of EGFP inE.coliBL21-1 in the blue light(left)and in natural light(right)

圖4 E.coliBL21-1菌落在自然光下形態(tài)Fig.4 Colonies of E.coliBL21-1 in natural light

3 討 論

外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)常常對宿主造成很強的代謝負(fù)擔(dān),表達(dá)的目的蛋白有時會對宿主菌有“毒性”作用。而GFP恰恰克服了這一障礙,大部分研究認(rèn)為作為分子標(biāo)記物,GFP對細(xì)胞無毒性且對細(xì)胞生長代謝和細(xì)胞功能均無影響,無疑成為眾多科研人員的理想選擇。

本實驗選擇的EGFP是野生型GFP的改造型,其所產(chǎn)生的熒光比野生型GFP亮35倍,可以顯著提高其檢測的靈敏度;同時本研究中選擇pET28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體,該質(zhì)粒含有強啟動子T7啟動子,可以使目的基因得到高效表達(dá)。以上表明,pET28a-EGFP重組表達(dá)載體能使EGFP基因和pET28a質(zhì)粒充分發(fā)揮各自的優(yōu)良特性。若GFP直接作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記食源性病原菌,不僅可以克服熒光染料分布不均勻,易滲漏,隨細(xì)胞分裂被稀釋的缺點[9],也易于進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。

目前,國內(nèi)關(guān)于GFP的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[10-12],在食品科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究很少,國外有將GFP標(biāo)記食源性病原菌對其進(jìn)行跟蹤監(jiān)測的報道[13]。本實驗將EGFP片段與pET28a載體連接,獲得重組質(zhì)粒pET28a-EGFP并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21工程菌中,GFP在自然光及熒光顯微鏡下均得到高效表達(dá),為以后標(biāo)記其他食源性病原菌并對其進(jìn)行跟蹤監(jiān)測提供了理論依據(jù)。

[1] Shimomura O,Johnson FH,Saiga Y.Extraction,purification and properties of aequorin,a bioluminescent proteinfrom the luminous hydromedusan,Aequorea[J].J.Cell.Comp.Physiol.,1962,59(3):223-239.

[2] 吳沛橋,巴曉革,胡海,等.綠色熒光蛋白GFP的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,2009,28(1):83-86.

[3] 馬金石.綠色熒光蛋白[J].化學(xué)通報,2009,72(3):243-250.

[4] 代文杰,呂曉穎,周保國,等.人源化綠色熒光蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)檢測[J].肝膽胰外科雜志,2002,14(4):213-214.

[5] Park K W,Cheong HT,LaiL,et al.Production of nuclear transfer derived s wine that express the enhanced green fluorescent protein[J].AniBiotech,2001,12(2):173-181.

[6] Skadsen RW,Hohn T M.Use of Fusarium graminearum transformed with gfp to follow infection patterns in barley and Arabidopsis[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2004,64(1):45-53.

[7] Khodjakov A,Terra SL,Chang F.Laser microsurgery in fission yeast:role of the mitotic spindle midzone in Anaphase B[J].Current Biology,2004,14(15):1330-1340.

[8] Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].北京:科學(xué)出版社,1992:55-57.

[9] 張國增,李瑞玲,王強.熒光染料在植物細(xì)胞Ca2+濃度測定中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010,26(9):198-201.

[10] 郝鋼躍,張維東,張月英,等.穩(wěn)定高表達(dá)增強型綠色熒光蛋白基因膀胱癌細(xì)胞株的構(gòu)建[J].山東醫(yī)藥,2009,49(46):1-3.

[11] 王婧,李昌,李林溪,等.反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)H IV-1 Gag蛋白和增強型綠色熒光蛋白細(xì)胞系的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2011,42(2):203-209.

[12] 金鷹,邢達(dá).腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的GFP蛋白的熒光漂白特性的研究[J].光譜與光譜分析,2004,24(12):1626-1629.

[13] Alicia EC,Romilio TE,Jaime R.TracingVibrio parahae molyticusin oysters(Tiostrea chilensis)using a Green Fluorescent Protein tag[J].J.Exp.Mar.Biol.Ecol.,2005,327(2):157-166.