劉美鳳蔣利榮劉華鼐林靜群

(1.華南理工大學化學與化工學院，廣東廣州510640;2.廣東省綠色化學產(chǎn)品技術重點實驗室，廣東廣州510640)

II型糖尿病占糖尿病發(fā)病群體的90%，其發(fā)生的主要機制為胰島素抵抗，在分子水平上表現(xiàn)為胰島素與受體結合后信號向細胞內轉導障礙.蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)在胰島素上游信號轉導鏈中起負向調節(jié)作用［1］，可使蛋白酪氨酸去磷酸化，從而阻斷胰島素與受體結合過程的信號轉導［2］，導致胰島素抵抗，致使血糖升高.過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是脂肪合成、能量穩(wěn)定、糖脂代謝平衡的關鍵調控因子，激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)可增強胰島素與其受體結合的信號傳導，提高胰島素的敏感性，從而有效降低血糖.此外，PPARγ還可減弱腫瘤壞死因子α和瘦素誘導的胰島素抵抗［3］.PTP1B和PPARγ已成為治療II型糖尿病新穎的靶標.另外，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制劑可減少葡萄糖的產(chǎn)生和攝取，降低餐后血糖.因此，篩選和尋找安全有效的α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制劑是藥學家的關注熱點.

番石榴葉為桃金娘科植物番石榴Psidium guajavaL.的干燥葉及帶葉嫩莖，其提取物具有抗氧化、清除自由基、保護心臟［4］、降血糖和降血壓［5］等多種藥理活性.對其的化學研究主要圍繞著抗微生物和治療急性腹瀉及痙攣活性，分離得到黃酮和三萜類化合物［6-10］，但番石榴葉治療II型糖尿病的活性成分及其機理尚不清楚.Discovery Studio2.1軟件中的CDOCKER模塊是基于CHARMm的半柔性對接程序，采用Softcore Potentials以及Optional grid representation將配體分子與受體活性位點進行對接.文中在化學成分研究的基礎上，借助Discovery Studio 2.1軟件的CDOCKER模塊，以番石榴葉中分離得到的和已知的三萜皂苷類、黃酮類和鞣質類化合物為配體，分別與PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶進行分子對接，根據(jù)其對接位點數(shù)和對接親和能的大小進行打分，分析番石榴葉治療II型糖尿病的活性成分，為進一步的理性設計提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 酶/受體結構信息來源及處理

從Brookhaven蛋白質數(shù)據(jù)庫(http:∥www.rcsb.org/pdb/home/home.do)下載所用到的PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶的三維結構模型.使用Discovery Studio軟件中的Protein Reports and Utilities Tools除去單晶衍射圖中的水分子、金屬離子、乙酸分子，只保留這4個蛋白分子與原始配體，優(yōu)化氫鍵值設為Sample Water Orientations，最后得到可用于對接的PTP1B、PPARγ、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的三維立體結構.

1.2 配體小分子化合物庫的準備

番石榴葉中分離得到和已知的共32個化合物為配體小分子化合物庫，主要含有三萜皂苷、黃酮以及鞣質類化合物［11］，見表1.首先利用Discovery Studio軟件的繪圖功能，繪制出化合物的立體結構，接著對其進行加氫、加電荷，最后對小分子的構象進行能量優(yōu)化處理.

表1 番石榴葉中的化合物Table 1 Compounds in Psidium guajava leaf

續(xù)表1

1.3 配體與酶/受體的分子對接

利用Discovery Studio 2.1軟件的CDOCKER模塊進行分子對接，當對接完成后，可以在Out put的文件夾里看到對接的結果.分子對接的結果以對接能作為對接分值的打分指標，對接能的負絕對值越大，證明受體與底物的對接親和力越大，同時也預測小分子與受體結合的活性越高.

2 結果與討論

2.1 與PTP1B的作用

表2 番石榴葉中小分子化合物與PTP1B的對接結果Table 2 Docking results of PTP1B with small molecules compounds in Psidium guajava leaf

與PTP1B進行分子對接的結果見表2.三萜皂苷類化合物沒有對接位點，而黃酮類化合物中，山奈酚的親和活性最強，其分子對接效果見圖1(a).可見2-苯基色原酮為母核的黃酮類化合物，若C-2位連接的苯環(huán)與母核不在同一平面時，將大大降低PTP1B和化合物的親和能力，空間結構或許是其中主要的影響因素;而連接上糖苷的黃酮類化合物無對接位點.PTP1B與咖啡酸、沒食子酸、原兒茶酸和阿魏酸的對接能量低，對接活性較高，可能與其結構簡單、空間位阻小，且其酚羥基的間位都接有羧基或者丙烯酸結構有關.PTP1B與咖啡酸的對接效果見圖1(b).

圖1 PTP1B與山奈酚分子和咖啡酸分子的對接效果Fig.1 Molecule modeling of PTP1B docked with kaempferol and caffic acid

2.2 與PPARγ的作用

表3 番石榴葉中小分子化合物與PPARγ對接結果Table 3 Docking results of PPARγreceptor with small molecules compounds in Psidium Guajava leaf

圖2 PPARγ與α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、沒食子酸的分子對接效果Fig.2 Moleculemodeling of PPARγdocked withα-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside，querecetin and gallic acid

與PPARγ進行分子對接時，3類化合物均有對接位點(見表3)，對接效果最好的為α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素和沒食子酸(見圖2).其中，α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對接位點比β-谷甾醇多，但后者與受體的親和力卻要強得多，可能與β-谷甾醇的構型以及其糖基化后空間結構變化有關.三環(huán)共平面的化合物與PPARγ的親和力更好.鞣質類化合物的酸性以及其空間的平面結構對其對接結果有直接的影響.

2.3 與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的作用

分別用α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶與配體庫內化合物依次進行分子對接，自動搜索后對接位點數(shù)為0.這可能是由于α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的結合空腔過于狹窄，而Discovery Studio軟件比較適合球形空腔的分子對接，因此在自動搜索時出現(xiàn)沒有任何對接位點的情況.

2.4 討論

文中通過分子模擬和對接評分的方法，篩選出番石榴葉中能與PTP1B、PPARγ對接的化合物，其中黃酮和鞣質類化合物與PTP1B和PPARγ的結合活性較高，尤其是山奈酚、沒食子酸、Guavin B、α-谷甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷這4個小分子化合物.

與PTP1B對接時，若底物含有苯環(huán)，則對接分值比較理想，但連接上糖苷后，會降低對接的可能性.若底物含有無取代苯環(huán)基團的小分子化合物，則其對接分值較差.含有直鏈烷烴型的小分子對接分值理想，但(CH2)n中n＞3，則對接分值不理想;當受體為PPARγ，四環(huán)三萜類的對接分值比五環(huán)三萜類理想，而且在C-2位連接上糖苷鍵后有較大的提高.當?shù)孜餅榉宇悤r，含有糖苷鍵的小分子化合物比直鏈烷烴型的對接分值理想，且其烷烴鏈越長，對接分值越理想.

番石榴葉中黃酮類以及鞣質類化合物與蛋白質受體的活性部位間的作用并沒有結合水分子的參與，二者通過疏水作用和氫鍵作用相互結合.因此，可以對活性較高的黃酮類、鞣質類小分子進行立體結構改造，引入有疏水作用的基團，提高其與PTP1B酶和PPARγ對接的親和活性，進一步提高其抗糖尿病活性.

3 結語

文中采用虛擬篩選的方法所得結果，一定程度上佐證了Oh等［12］給出的番石榴葉提取物通過抑制PTP1B活性而降低Leprdb/Leprdb小鼠血糖的結論.盡管虛擬篩選有可能存在假陽性結果，與動物實驗和體外實驗結果可能會有一定偏差，但分子模擬這種方法針對性強，是一種較好的藥物篩選手段，尤其可為后期基于藥物靶標的活性成分研究和結構修飾提供重要的指導和借鑒.

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