房守敏 伍春蓮

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南充 637002)

熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)是應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)優(yōu)先合成的一組蛋白質(zhì),在原核和真核生物中普遍存在,參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、跨膜、轉(zhuǎn)運(yùn)以及變性蛋白質(zhì)的清除等(Feder and Hofmann,1999;程維杰等,2008)。熱激蛋白70(HSP70)是廣泛存在且是一組在進(jìn)化上高度保守的應(yīng)激蛋白,在原核生物和真核生物體內(nèi)都存在,并存在于所有的細(xì)胞區(qū)室和器官中,是當(dāng)前研究較廣泛的HSP家族。HSP70家族的成員數(shù)量在不同的生物有所不同,功能亦存在差異由分子量70 kD的熱休克蛋白(誘導(dǎo)型)在正常細(xì)胞中水平較低,在應(yīng)激狀態(tài)下可顯著升高(Mc-Millan et al.,2005;Bahrndorff et al.,2009)。大量研究表明機(jī)體細(xì)胞在受到各種應(yīng)激,如高熱,缺氧等有害應(yīng)激時(shí),產(chǎn)生的HSP70可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)下一次有害損傷的耐受程度,維持細(xì)胞的正常功能代謝,提高細(xì)胞生存率(楊秉芬等,2009)。因此,HSP70對(duì)正常和非正常狀態(tài)下的生物體的生存作用是非常負(fù)責(zé)和重要的,深入全面的了解HSP70對(duì)機(jī)體的作用將對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn),人類(lèi)生活,生物機(jī)體疾病預(yù)防起到重大影響。

在大多數(shù)生物體中,HSP70家族是由分子量為68、70、72及78 kD的熱休克蛋白組成。它們的分子量相近,等電點(diǎn)為pH 5.2～6.3之間,幾乎分布于每個(gè)細(xì)胞器中(Feder and Hofmann,1999;Johnston et al.,1998)。大量研究證明HSP70是生物體中少數(shù)最保守蛋白之一,無(wú)論是何種物種(原核細(xì)胞和真核細(xì)胞)的HSP70的氨基酸序列均至少有45%的同源性,越是相近的物種同源性越高(Feder and Hofmann,1999)。HSP70都有“卷線樣”構(gòu)象段,就象其它蛋白一樣有絞鏈部分(如肌球蛋白),是ATP依賴的構(gòu)像變化,這些豐富的ATP結(jié)合蛋白已成為所有熱休克蛋白中最具特色和研究最多的之一(任寶波等,2005;王宇萍和蔣建東,2010)。

電子克隆(electronic cloning)是近年來(lái)伴隨著基因組計(jì)劃和ESTs計(jì)劃而發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法,主要原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù),借助電子計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力,通過(guò)EST或基因組序列組裝和拼接,進(jìn)一步利用RT-PCR的方法快速克隆功能基因(Wang et al.,2007;林生等,2009)。本實(shí)驗(yàn)利用電子克隆技術(shù),以黑腹果蠅HSP70蛋白的氨基酸序列在家蠶的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查找、比對(duì)得到其同源的DNA序列和相應(yīng)的EST,通過(guò)序列組裝和拼接來(lái)獲得家蠶的HSP70的cDNA序列,并利用生物信息學(xué)的軟件來(lái)分析其序列信息,預(yù)測(cè)和分析其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)、分子量等,為進(jìn)一步克隆和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)

黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的HSP70(GenBank檢索號(hào)AAG22148.2)氨基酸序列下載自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為西南大學(xué)SilkDB(www.silkdb.org/silkdb/)。

1.2 軟件

同源性比對(duì)采用從NCBI下載的BLAST(basic local alignment Search tool)工具。EST s序列的拼接使用DNASTAR中的SeqMan軟件。預(yù)測(cè)基因的外顯子、內(nèi)含子結(jié)構(gòu)采用Sim4程序:http://gamay.univ-perp.Fr/analyse-seq/sim4。蛋白質(zhì)序列翻譯的在線工具:http://www.expasy.ch/tools/dna.html分子量MW/等電點(diǎn)pI的預(yù)測(cè)http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html。

1.3 方法

以黑腹果蠅HSP70的氨基酸序列與家蠶基因組預(yù)測(cè)的基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.silkdb.org/silkdb/)進(jìn)行tBlastn同源性檢索,挑取相似高的BGIBMGA002381基因作為本研究的候選基因。以家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的CDS序列與家蠶ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastn比對(duì),獲得的EST s序列用DNASTAR中的SeqMan進(jìn)行拼接,將延伸的序列為種子序列應(yīng)用Blastn程序檢索家蠶EST s庫(kù),將檢索到的EST s序列再次用DNASTAR中的SeqMan進(jìn)行電子延伸,延伸步驟直到不能延伸為止。經(jīng)SeqMan獲得的拼接序列與家蠶基因組進(jìn)行Blastn比對(duì),從而找到其相應(yīng)的基因組序列。提取該家蠶HSP70所對(duì)應(yīng)的基因組序列,以Sim4軟件分析基因結(jié)構(gòu)。利用http://www.expasy.ch/tools/dna.html在線工具預(yù)測(cè)其氨基酸序列;利用http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.htm l在線工具預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的分子量MW/等電點(diǎn)pI。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmHSP70基因的電子克隆

以黑腹果蠅的HSP70蛋白作為檢索序列與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://silkworm.swu.edu.cn)進(jìn)行tBlastn比對(duì)搜索,共獲得了多個(gè)可能的熱休克蛋白70同源基因,我們挑取其中與黑腹果蠅的HSP70相似較高的BGIBMGA002381進(jìn)行了電子克隆。將家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的BGIBMGA002381編碼區(qū)序列(coding sequence,CDS)與NCBI中家蠶表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags,ESTs)數(shù)據(jù)庫(kù)作Blastn比對(duì)檢索,共檢索得到20條可靠的ESTs(圖1)。利用DNASTAR軟件對(duì)家蠶HSP70的ESTs序列拼接和延伸,得到其長(zhǎng)度為2 057 bp的cDNA序列。將拼接的cDNA在Softberry網(wǎng)站進(jìn)行在線基因預(yù)測(cè),結(jié)果表明該基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 950 bp,共編碼649個(gè)氨基酸。

圖1 BmHSP70基因的ESTs分析

2.2 BmHSP70基因的序列分析

將BmHSP70基因的ESTs拼接序列與家蠶基因組序列進(jìn)行Blastn比對(duì),獲取BmHSP70基因的基因組序列,利用Sim4程序分析基因結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2所示。BmHSP70基因的ESTs拼接序列含有2個(gè)外顯子和3個(gè)外顯子,內(nèi)含子邊界均符合標(biāo)準(zhǔn)的GT/AG規(guī)則。

圖2 家蠶BmHSP70基因的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

BmHSP70基因的核苷酸序列和推到的氨基酸序列如圖3所示。經(jīng)預(yù)測(cè)BmHSP70蛋白的分子量為71.18 kD,等電點(diǎn)pI為5.33。用蛋白質(zhì)軟件Antheprot分析家蠶HSP70蛋白,發(fā)現(xiàn)3個(gè)HSP家族的簽名序列:IDLGTT YS(9-16殘基),IFDLGGGTFDVSIL(197-210殘基)和IVLVGGST RIPKVQK(334-348殘基);Dank特征基序DLGTT-S-V(10-18殘基),非細(xì)胞器基序RARFEEL(298-304殘基),胞質(zhì)HSP70特征基序GPTIEEVD(645-652殘基)以及靠近C端的GGMP 4肽序列;2個(gè)糖基化位點(diǎn)NKSI和NVSA。根據(jù)所獲得的序列符合HSP70家族特有的氨基酸序列特征,因此確認(rèn)該序列是家蠶HSP70基因完整編碼區(qū)cDNA序列(崔亞?wèn)|等,2010)。

通過(guò)應(yīng)用Clustral X和MEGA4.0軟件,以家蠶HSP70與其它昆蟲(chóng)HSP70氨基酸序列建立建鄰近進(jìn)化樹(shù)(Neighbor-joining method)。結(jié)果顯示,BmHSP70與粉莖螟和二化螟HSP70的親緣關(guān)系較近,在進(jìn)化樹(shù)中聚為一支,而且有很高的置信值(圖4)。通過(guò)氨基酸相似性計(jì)算,表明家蠶BmHSP70與其他HSP70高度相似,特別是與粉莖螟和二化螟HSP70的相似性高達(dá)98.0%和97.2%,即使在進(jìn)化樹(shù)中表現(xiàn)出與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的美洲斑潛蠅、黑腹果蠅、埃及伊蚊、淡色庫(kù)蚊和致倦庫(kù)蚊的HSP70間相似性也高達(dá)75%左右。

圖3 BmHSP70基因的核苷酸序列和推到的氨基酸序列

圖4 家蠶和其他昆蟲(chóng)HSPs的NJ樹(shù)

3 討論

本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,采用電子克隆技術(shù),得到了家蠶HSP70的基因BGIBMGA002381。分析表明該基因的cDNA序列長(zhǎng)2 057 bp,其編碼區(qū)長(zhǎng)1 950 bp,共編碼649個(gè)氨基酸。該基因由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成,其內(nèi)含子邊界均符合GT/AG規(guī)則。BmHSP70蛋白的分子質(zhì)量為71.18 kD,等電點(diǎn)為5.33。序列分析表明BmHSP70蛋白具有HSP70保守的特征序列,而且具有大量的ESTs證據(jù),表明該基因可能為家蠶體內(nèi)有功能HSP70基因。BmHSP70與其他昆蟲(chóng)HSP70的氨基酸序列非常保守,特別是與粉莖螟和二化螟HSP70的相似性高達(dá)98.0%和97.2%。

本實(shí)驗(yàn)主要介紹了基于Internet網(wǎng)上生物信息資源對(duì)新基因全長(zhǎng)cDNA的電子克隆策略,對(duì)于那些需要經(jīng)常進(jìn)行序列分析,或者分析規(guī)模較大的實(shí)驗(yàn)室,可以構(gòu)建本地的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺(tái),把一些重復(fù)性的、可程序化的過(guò)程直接交由計(jì)算機(jī)完成,用戶的主要精力就可轉(zhuǎn)移到對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上,能節(jié)約大量的人力和物力。

生物信息學(xué)方法的應(yīng)用使新基因全長(zhǎng)cDNA克隆和分析的方法不斷更新,朝著快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的方向發(fā)展,但鑒于生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性,許多分析軟件的輸出結(jié)果存在較大的偏差,因此利用生物信息學(xué)進(jìn)行的“虛擬”克隆的結(jié)果尚需回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證。但是,這種分析方法為實(shí)驗(yàn)研究提供了重要的線索,對(duì)隨后的研究起到了“事半功倍”的作用,避免走彎路,極大地提高了工作效率?？梢韵嘈烹S著基因組序列信息的日益豐富,計(jì)算方法和數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善,生物信息學(xué)將在基因全長(zhǎng)cDNA克隆和分析中扮演更加重要的角色。

[1]Bahrndorff S,Marien J,Loeschcke V,et al.Dynamics of heat-induced thermal stress resistance and hsp70 expression in the springtail,Orchesella cincta[J].Funct.Ecol.,2009,23(2):233-239.

[2]Feder M E,Hofmann GE.Heat-shock proteins,molecular chaperones,and the stress response:evolutionary and ecological physiology[J].Annu Rev Physiol,1999,61:243-282.

[3]Johnston J A,Ward C L,Kopito R R.Aggresomes:a cellular response to misfolded proteins[J].J Cell Biol,1998,143(7):1883-1898.

[4]McMillan D M,Fearnley S L,Rank N E,et al.Natural temperature variation affects larval survival,development and Hsp70 expression in a leaf beetle[J].Funct Ecol,2005,19(5):844-852.

[5]Wang H T,Chang J W,Guo Z,et al.In silico-initiated cloning and molecular characterization of cortexin 3,a novel specifically expressed in the kidney and brain,and well conserved in vertebrates[J].Int J Mol Med,2007,20(4):501-510.

[6]程維杰,李秋玲,孫延鳴,等.熱休克蛋70(HSP70)研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(6):55-57.

[7]崔亞?wèn)|,陸明星,杜予州.二化螟熱休克蛋白70基因的克隆及熱脅迫下的表達(dá)分析[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2010,53(8):841-848.

[8]林生,潘大仁,周以飛,等.果蔗Hsp90基因的電子克隆及序列分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2009,30(12):1824-1830.

[9]任寶波,王玉艷,王純凈,等.HSP70家族的分類(lèi)及基因結(jié)構(gòu)與功能[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(1):98-101.

[10]楊秉芬,孫啟,鴻曹誠(chéng).熱激蛋白70研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2009,20(5):716-718.

[11]王宇萍,蔣建東.熱休克蛋白70的結(jié)構(gòu)和功能[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(2):305-313.