鄭愛娟 劉國華 董曉玲 李 勇 陳桂蘭

小肽是氨基酸吸收的主要形式，飼糧中的大部分氨基酸是以小肽的形式通過依賴于H+的Ⅰ型小肽轉運載體(PepT1)在小腸內被吸收。研究表明，動物小腸(或腸細胞)對肽的吸收受飼糧和營養(yǎng)［1-6］、饑餓［7-9］、腸道損傷［10-11］、燒傷［12］、缺氧［13］、晝夜變化［14］等多種因素的影響，其中大部分因素是通過影響PepT1 mRNA表達而起作用。至今尚未詳細了解其作用途徑，但鑒于多種激素和活性因子都在物質跨膜轉運中發(fā)揮著配體(第一信使)作用，因此研究激素和活性因子對PepT1 mRNA表達的影響將有助于揭示肽轉運調控的生理和生化機制。目前已經報道了胰島素［15-17］、生長激素［12-13］、表皮生長因子(EGF)［15，18］、腎上腺素受體激動劑［19］、瘦素［20］和三碘甲狀腺原氨酸(T3)［21］對肽轉運的影響，并對肽轉運系統的調控機制進行了初步探討。但現有的研究報道大部分是以哺乳動物細胞或轉基因細胞為模型，而以禽類為動物模型的研究尚不多見。本試驗擬通過研究甲狀腺素、胰高血糖素(pancreas glucagon，PG)和EGF對肉雞小腸PepT1 mRNA表達的影響，為探討肽轉運載體調控機制，進一步揭示肉雞對小肽的吸收轉運機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

左旋甲狀腺素鈉(T4，天津赫素制藥有限公司)、PG(Sigma Aldrich公司)、EGF(Sigma Aldrich公司)、甲巰咪唑(methimazole，北京雙橋制藥公司)。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選用50只1日齡健康雄性肉仔雞，按常規(guī)飼養(yǎng)管理至25日齡，為預試期。期間自由采食玉米-豆粕型飼糧，自由飲水，24 h光照。1日齡注射接種馬立克氏疫苗，7日齡滴鼻接種新城疫弱毒-腎傳支二聯疫苗。

1.3 試驗設計

預試期后，從上述肉雞中選擇體重無差異的25日齡雄性肉仔雞30只，分為5組，每組6只雞，分別接受不同激素處理，每天1次，連續(xù)5 d。對照組、EGF組、PG組分別皮下注射蒸餾水0.20 mL/kg、EGF 0.03 mg/kg、PG 0.10 mg/kg;T4組、TH 組分別灌服 T4330.00 μg/kg、甲巰咪唑(抗甲狀腺藥物)25.00 mg/kg，同時皮下注射蒸餾水 0.20 mL/kg。

T4參照大鼠甲亢模型［22］的劑量給藥，PG參照大鼠外源PG試驗模型［23］的劑量給藥，EGF參照多器官功能障礙綜合征(MODS)小鼠模型治療有效劑量［24］給藥，甲巰咪唑參照甲狀腺功能減退癥大鼠模型［25］的劑量給藥。

試驗雞接受最后1次處理12 h后采血，制備血清;乙醚麻醉后宰殺，取十二指腸、空腸、回腸中段各1 cm，用冷生理鹽水沖洗腸段后液氮速凍，放入超低溫冰箱保存待測。

1.4 指標及測定方法

1.4.1 血清 T3、人表皮生長因子(h-EGF)和 PG含量測定

血清T3、h-EGF和PG含量分別采用T3放免試劑盒(HY-03)、h-EGF放免試劑盒(HY-058)和PG放免試劑盒(HY-039)測定。試劑盒均為北京華英生物技術研究所產品。計數器采用GC-911型γ放免計數器(中國科大光電儀器中佳分公司)。

1.4.2 小腸PepT1 mRNA表達量測定

采用離心柱型總RNA提取試劑盒(RNAultra，北京天為時代科技有限公司產品)提取腸組織總RNA，然后進行反轉錄。參考 PepT1基因［AY029615(2 914 bp)］序列設計特異性引物，上游引物為:5'-TAGACTGGGCAAGCGTCTT-3'，下游引物為:5'-TTTGCAACGACGACGAGAA-3'，產物長度為347 bp;內參基因β-肌動蛋白(β-actin)上游引物為:5'-TGAACAAGCCCAGAGGTTT-3'，下游引物為:5'-ATCTAAGAACGGATACCTCAGG-3'，產物長度為649 bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。

使用PCR儀(Gene Amp PCR system 9700型，美國Applied Biosystem公司)進行PCR擴增。反應體系為:cDNA模板和Taq DNA聚合酶各1μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，MgSO4(100 mmol/L)0.25 μL，上 下 游 引 物(10μmol/L)各1μL，加無菌蒸餾水至50μL。

擴增條件為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 45 s，29 個循環(huán)，72℃延伸5 min。溴化乙錠染色，電泳儀(DYY-Ⅲ31A型，北京市六一儀器廠)電泳，紫外凝膠分析儀拍照，采用Bio-1D++(法國Vilber Lourmat公司)軟件分析結果，計算PepT1 mRNA的相對表達量。

1.5 數據處理及統計分析

采用Statistica 6.0統計軟件One-way ANOVA程序進行單因素方差分析，Fisher’s LSD法多重比較，以 P＜0.05、P ＜0.01分別作為差異顯著和極顯著標準。

2 結果

2.1 雞血清 h-EGF、T 3、PG 含量

由表1可知，連續(xù)5 d皮下注射EGF和PG對血清中h-EGF和PG含量無顯著影響(P＞0.05);口服T4顯著提高血清T3含量(P＜0.05)，口服甲巰咪唑則顯著降低血清T3含量(P＜0.05)。

2.2 雞小腸Pep T1 mRNA表達量

由圖1和表2可知，不同激素處理對雞小腸PepT1 mRNA表達量有顯著影響(P＜0.05)。皮下注射PG(P ＜0.05)和口服T4(P ＜0.01)均顯著提高了雞小腸各腸段PepT1 mRNA表達量平均值，表明二者對雞小腸PepT1 mRNA表達有上調作用，其中以T4的上調作用更為明顯。皮下注射EGF和口服甲巰咪唑有降低PepT1 mRNA表達量的趨勢，但均未達到顯著水平(P＞0.05)。

3 討論

3.1 甲狀腺素對雞小腸Pep T1 mRNA表達的調控

甲狀腺素的主要功能是維持動物正常生長發(fā)育、保持正常體溫和能量代謝，其生理功能主要是通過與細胞核受體結合、加速mRNA形成并促進蛋白質合成。已知動物細胞內存在著一類DNA轉錄調節(jié)型受體系統，該類受體與甲狀腺素和類固醇激素結合，激活mRNA的轉錄和轉運蛋白的表達。Matosin-Matekalo等［26］報道，T3處理的Caco-2/TC7克隆細胞對葡萄糖的吸收提高了10倍，葡萄糖轉運蛋白(SGLT1)mRNA表達量也隨T3劑量的提高而提高，Na+，K+-ATP酶含量也有明顯增加。另有研究同樣發(fā)現，T3處理也以劑量依賴的方式提高葡萄糖轉運蛋白(GLUT5)mRNA表達量［27］。關于甲狀腺素對PepT1 mRNA表達影響機制的研究還未見報道。

表1 EGF、PG和T 4對雞血清相應激素含量的影響Table 1 Effects of EGF，PG and T4 on contents of according hormones in serum of broilers

圖1 雞小腸Pep T1和β－肌動蛋白基因RT-PCR產物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of the RT-PCR products of PepT1 andβ-actin gene in small intestine of broilers

本次試驗中連續(xù)5 d口服T4顯著提高血清T3水平，并在轉錄水平上顯著上調了PepT1 mRNA表達;而連續(xù)5 d口服甲狀腺抑制劑則顯著降低血清T3水平，PepT1 mRNA表達略低于對照組;表明T3水平與PepT1 mRNA表達之間存在一定的劑量依賴關系。這些結果表明，DNA轉錄調節(jié)型受體系統可能是調控肽轉運系統信號過膜傳導的途徑之一。但據Ashida等［21］報道，T3處理在促進甲酰葡萄糖苷和蘇氨酸吸收的同時，卻抑制了Caco-2細胞對甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)的吸收，并降低了PepT1 mRNA表達量和PepT1蛋白含量，與本試驗結果不一致，可能與哺乳動物和鳥類以及體組織和離體培養(yǎng)細胞之間的差異有關。

3.2 EGF對雞小腸Pep T1 mRNA表達的調控

EGF是一類重要的生長因子，它是由50～60個氨基酸分子組成的多肽類活性物質。其主要功能是促進間質及上皮細胞增殖和分化，促進成纖維細胞和內皮細胞增殖，在體內介導上皮生長，促進血管形成，抑制胃酸分泌，加速傷口愈合等。近年來研究表明，EGF在腸道營養(yǎng)物質吸收方面也發(fā)揮著重要作用。

EGF具有調控肽轉運系統的作用。Nielsen等［18］報道，EGF長期(26～28 d)培養(yǎng) Caco-2 細胞使其Gly-Sar轉運量降低約50%，轉運最大速率降低90%，同時PepT1 mRNA表達量和細胞膜PepT1蛋白含量都明顯降低，表明EGF是通過下調PepT1 mRNA表達降低細胞二肽轉運能力的。另外，Nielsen等［15］發(fā)現 EGF 短期(5 min)刺激即能增加Caco-2細胞攝取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后達到平臺期，轉運最大速率提高了約50%，但并未影響PepT1 mRNA表達量和H+濃度，同時其促轉運作用未受蛋白轉運抑制劑(brefeldin A)的影響，表明 EGF處理不會影響PepT1蛋白的合成。

表2 EGF、PG和T 4對雞小腸PepT1 mRNA表達量的影響Table 2 Effects of EGF，PG and T4 on the expression level of PepT1 mRNA in the small intestine of broilers

本試驗未能觀察到注射EGF對其在血清中含量和PepT1 mRNA表達量的顯著作用，可能是本試驗所用的h-EGF與雞的表皮生長因子受體(EGFR)親和力較差(人類和雞的EGFR同源性為75%)，掩蓋了EGF的作用，也有可能與藥劑量較低有關。但PepT1 mRNA表達量有降低的趨勢，與上述文獻報道中長期效應的研究結果一致。

3.3 PG對雞小腸Pep T1 mRNA表達的調控

PG是由胰島細胞分泌的一種多肽激素。其主要功能是促進糖原分解和糖異生作用，使血糖升高。其作用是通過環(huán)腺苷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)系統，激活肝細胞的磷酸化酶，加速糖原分解。此外，PG也能以腸細胞作為靶細胞，促進營養(yǎng)物質的吸收［28］。Thompson 等［29］在大鼠腹腔注射PG顯著增加空腸細胞刷狀緣膜電位，使葡萄糖和半乳糖的吸收提高50%以上，并可能增加纈氨酸的吸收。Debnam等［30］報道了PG可以直接作用于大鼠空腸上皮細胞，促進刷狀緣膜微囊和基底膜微囊對半乳糖的吸收。而迄今關于PG與肽轉運之間的聯系仍未見研究報道。此外，現有報道中也未發(fā)現PG對營養(yǎng)吸收相關基因表達的影響。

本試驗中，注射PG并未顯著影響其在血清中含量，可能與PG極短的半衰期(5～10 min)有關。但每天1次的PG注射仍然影響了雞小腸PepT1 mRNA表達量，在轉錄水平上上調了PepT1 mRNA表達量，顯然PG具有促進雞小肽吸收轉運的潛力。但其是否確實存在該生理功能仍需進一步研究證實。

4 結論

①口服T4、甲巰咪唑分別顯著提高、顯著降低血清T3含量。

②皮下注射PG和口服T4均顯著提高了雞小腸PepT1 mRNA表達量，而皮下注射EGF和口服甲巰咪唑對其無顯著影響。

［1］ ERICKSON R H，GUM-JR J，LINDSTROM M M，et al.Regional expression and dietary regulation of rat small intestinal peptide and amino acid transporter mRNAs［J］.Biochemical and Biophysical Research Communication，1995，216:249-257.

［2］ FERRARIS R P，DIAMOND J M，KWAN W W.Dietary regulation of intestinal transport of the dipeptide carnosine［J］.American Journal of Physiology，1988，255:G143-G150.

［3］ THAMOTHARAN M，BAWANI S Z，ZHOU X，et al.Mechanism of dipeptide stimulation of its own transport in a human intestinal cell line［J］.Proceedings of the Association of American Physicians，1998，110:361-368.

［4］ WALKER D，THWAITES D T，SIMMONS N L，et al.Substrate upregulation of the human small intestinal peptide transporter，hPepT1［J］.Journal of Physi-ology-London，1998，507:697-706.

［5］ SHIRAGA T，MIYAMOTO K，TANAKA H，et al.Cellular and molecular mechanisms of dietary regulation on rat intestinal H+/peptide transporter PepT1［J］.Gastroenterology，1999，116:354-362.

［6］ CHEN H.Cloning，expression，and developmental and dietary regulations of a chicken intestinal peptide transporter and characterization and regulation of an ovine gastrointestinal peptide transporter expressed in a mammalian cell line［D］.Ph.D.thesis.Blacksburg:Virginia Polytechnic Institute and State University，2001.

［7］ THAMOTHARAN M，BAWANI S Z，ZHOU X，et al.Functional and molecular expression of intestinal oligopeptide transporter(Pept-1)after a brief fast［J］.Metabolism，1999，48:681-684.

［8］ IHARA T，TSUJIKAWA T，FUJIYAMA Y.Regulation of PepT1 transporter expression in the rat small intestine under malnourished conditions［J］.Digestion，2000，61:59-67.

［9］ OGIHARA H，SUZUKI T，NAGAMACHI Y，et al.Peptide transporter in the rat small intestine:ultrastructural localization and the effect of starvation and administration of amino acids［J］.Histochemical Journal，1999，31:169-174.

［10］ TANAKA H，MIYAMOTO K I，MORITA K，et al.Regulation of the PepT1 peptide transporter in the rat small intestine in response to 5-fluorouracilinduced injury［J］.Gastroenterology，1998，114:714-723.

［11］ BARBOT L，WINDSOR E，ROME S，et al.Intestinal peptide transporter PepT1 is over-expressed during acute cryptosporidiosis in suckling rats as a result of both malnutrition and experimental parasite infection［J］.Parasitology Research，2003，89:364-370.

［12］ SUN B W，ZHAO X C，WANG G L，et al.Changes of biological functions of dipeptide transporter(PepT1)and hormonal regulation in severe scald rats［J］.World Journal of Gastroenterology，2003，9(12):2782-2785.

［13］ 孫炳偉，趙小辰，王廣基，等.缺氧復氧損傷后小腸上皮細胞刷狀緣二肽轉運載體生物學功能的改變及生長激素的調控作用［J］.解放軍醫(yī)學雜志，2003，28(11):1025-1027.

［14］ PAN X，TERADA T，IRIE M，et al.Diurnal rhythm of H+-peptide cotransporter in rat small intestine［J］.American Journal Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2002，283:G57-G64.

［15］ NIELSEN C U，AMSTRUP J，NIELSEN R，et al.Epidermal growth factor and insulin short term increase hPepT1 mediated glycylsarcosine uptake in Caco2 cells［J］.Acta Physiologica Scandinavica，2003，178:139-148.

［16］ THAMOTHARAN M，BAWANI S Z，ZHOU X，et al.Hormonal regulation of oligopeptide transporter Pept-1 in a human intestinal cell line［J］.American Journal of Physiology，1999，276:C821-C826.

［17］ MEREDITH D，BOYD C A.Structure and function of eukaryotic peptide transporters［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2000，57:754-778.

［18］ NIELSEN C U，AMSTRUP J，STEFFANSEN B，et al.Epidermal growth factor inhibits glycylsarcosine transport and hPepT1 expression in a human intestinal cell line［J］.American Journal of Physiology，2001，281:G191-G199.

［19］ BERLIOZ F，MAORET J J，PARIS H，et al.Alpha(2)-adrenergic receptors stimulate oligopeptide transport in a human intestinal cell line［J］.Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2000，294:466-472.

［20］ BUYSE M，BERLIOZ F，GUILMEAU S，et al.PepT1-mediated epithelial transport of dipeptides and cephalexin is enhanced by luminal leptin in the small intestine［J］.Journal of Clinical Investigation，2001，108(10):1483-1494.

［21］ ASHIDA K，TOSHIYA K，HIDEYUKI M，et al.Thyroid hormone regulates the activity and expression of the peptide transporter PEPT1 in Caco-2 cells［J］.American Journal Physiology:Gastrointestinal and Liver Physiology，2002，282:G617-G623.

［22］ 王祎媛，侯連兵，蔡鴻福，等.甲狀腺素和利血平誘導小鼠甲亢陰虛證模型的制備［J］.中國藥業(yè)，2010，19(23):19-20.

［23］ 黃巖，李占淳，石愛榮.外源性胰高血糖素對大鼠胰島B細胞形態(tài)和功能的影響［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2000，9(1):61-64.

［24］ 汪倩，徐南平，鄒音.腹腔注射重組人表皮生長因子對多臟器功能障礙綜合征小鼠死亡率的影響［J］.江西醫(yī)藥，2010，45(5):409-412.

［25］ 王萍，殷洪博，劉長晟，等.碘缺乏、甲狀腺功能減退大鼠仔鼠海馬 c-fos、c-jun蛋白的表達［J］.中國地方病防治雜志，2005，20(1):6-8.

［26］ MATOSIN-MATEKALO M， MESONERO J E，DELEZAY O，et al.Thyroid hormone regulation of the Na+/glucose cotransporter SGLT1 in Caco-2 cells［J］.Biochemical Journal，1998，334:633-640.

［27］ MATOSIN-MATEKALO M，MESONERO J E，LAROCHE T J，et al.Glucose and thyroid hormone coregulate the expression of the intestinal fructose transporter GLUT5［J］.Biochemical Journal，1999，339:233-239.

［28］ 王琛，高宏凱，韓承新，等.葡萄糖依賴性促胰島素激素(GIP)表達變化對血糖穩(wěn)態(tài)的影響［J］.實用醫(yī)技雜志，2008，15(1):117-119.

［29］ THOMPSON C S，DEBNAM E S.Hyperglucagonaemia:effects on active nutrient uptake by the rat jejunum［J］.Journal of Endocrinology，1986，111(1):37-42.

［30］ DEBNAM E S，SHARP P A.Acute and chronic effects of pancreatic glucagon on sugar transport across the brush-border and basolateral membranes of rat jejunal enterocytes［J］.Experimental Physiology，1993，78(2):197-207.