楊利榮 張敏紅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸、可以被金屬等多種因素誘導(dǎo)的特異蛋白質(zhì)，于1957年首次在馬腎臟中發(fā)現(xiàn)并分離成功，后被證實普遍存在于多種真核生物體內(nèi)。

MT約30%的氨基酸是半胱氨酸，含有大量的巰基基團，因而引起了科學(xué)研究者的關(guān)注。目前研究顯示，MT作為機體的一種保護性蛋白質(zhì)參與多種應(yīng)激反應(yīng)。國內(nèi)外關(guān)于不同形式的刺激對MT的影響展開了大量的試驗，包括低溫刺激、皮膚創(chuàng)傷、電離輻射、重金屬暴露和不同劑量鋅飼喂等［1］。而有關(guān)MT在應(yīng)激反應(yīng)中的產(chǎn)生、調(diào)控及功能，國內(nèi)外尚缺乏深入、系統(tǒng)、前沿的文獻報道。故本文圍繞MT與應(yīng)激反應(yīng)這一主題展開論述，重點介紹了MT在應(yīng)激反應(yīng)中的產(chǎn)生、調(diào)控及功能，旨在為MT在畜禽應(yīng)激反應(yīng)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 M T在應(yīng)激反應(yīng)中的產(chǎn)生及相關(guān)調(diào)控

MT基因啟動子部位含有多種調(diào)控元件，如金屬反應(yīng)元件(MREs)、抗氧化反應(yīng)元件(ARE)、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(GREs)和轉(zhuǎn)錄激酶(STAT)反應(yīng)元件等［2－3］。MT這種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，決定了其容易被多種因素誘導(dǎo)的特性。

1.1 M T與重金屬毒性應(yīng)激

當(dāng)嚙齒類動物暴露于鎘、汞等重金屬離子時，肝臟MT合成增加［4－5］。重金屬對MT轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)主要通過金屬反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白因子－1(MTF-1)與啟動子部位的金屬反應(yīng)元件(MREs)相互作用實現(xiàn)的［6］。MTF-1在重金屬誘導(dǎo)的MT產(chǎn)生過程中必不可少。MTF-1基因缺乏，則重金屬無法誘導(dǎo) MT基因的表達［7］。盡管MTF-1控制MT合成的確切機制還不清楚，但已有大量文獻表明MTF-1蛋白上高度保守的6－鋅指DNA結(jié)合區(qū)作為鋅傳感區(qū)發(fā)揮功能，并且這6個不同鋅指之間的聯(lián)結(jié)子能夠積極參與調(diào)節(jié)MTF-1易位至細胞核內(nèi)，并綁定在MT基因啟動子部位［8］。

重金屬可以增加MTF-1與MREs結(jié)合的能力，從而增加MT的轉(zhuǎn)錄［7］。MTF-1結(jié)合在MRE上需要鋅的參與，盡管多種重金屬可以誘導(dǎo)MTF-1對MRE的結(jié)合活性，但只有鋅可以介導(dǎo)MTF-1結(jié)合到MREs上。因此，與MTF-1直接反應(yīng)的只有鋅，游離鋅通過變構(gòu)相互作用直接激活這種蛋白［9］。研究表明，重金屬鎘也能強烈誘導(dǎo)MT基因的轉(zhuǎn)錄，但并沒有增加MTF-1與DNA的結(jié)合活性［10］。因此，有人推測鎘并不依賴 MTF-1誘導(dǎo)MT的產(chǎn)生。同時認為，與鋅相比，鎘具有強氧化性，可能通過氧化應(yīng)激途徑。

1.2 M T與氧化應(yīng)激

可誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生的因子，如馬來酸二乙酯、百草枯、促凝血藥，都可導(dǎo)致嚙齒類動物肝臟MT mRNA 的增加［11－13］。當(dāng)小白鼠肝細胞暴露于活性氧產(chǎn)生器中，在不降低細胞活性的前提下，MT被誘導(dǎo)增加，并呈現(xiàn)劑量依賴性，這種增加基于MT基因的轉(zhuǎn)錄［14］。線粒體也是活性氧的一個主要來源。線粒體特異的活性氧發(fā)生劑，如抗霉素A、2，4 －二硝基苯酚也可誘導(dǎo) MT 的合成［15］。

據(jù)報道，活性氧可能通過多種途徑誘導(dǎo)MT的產(chǎn)生。例如，活性氧可與MT基因啟動子部位ARE結(jié)合直接反應(yīng)，也可間接通過增加細胞內(nèi)貯鋅蛋白，尤其是MT蛋白上鋅的釋放，增加的游離鋅又可通過MTF-1調(diào)節(jié)MT基因的轉(zhuǎn)錄［16］。活性氧也可與不同的第二信使蛋白激酶通路相關(guān)聯(lián)而介導(dǎo) MT的發(fā)生［17］。然而，目前活性氧介導(dǎo)MT產(chǎn)生的確切調(diào)節(jié)機制尚不清楚。

1.3 M T與物理應(yīng)激

急性固定、捆綁、寒冷等刺激時肝臟MT合成增加［18－19］。普遍認為糖皮質(zhì)激素(GCs)在這種應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［20－21］。用糖皮質(zhì)激素受體(GRs)阻斷劑RU486處理的小鼠，MT合成明顯不足［21］。

以上應(yīng)激激活了下丘腦－垂體－腎上腺軸，并且提高了GCs的水平。GCs誘導(dǎo)MT不依賴其他調(diào)控序列。GRs正常存在于細胞質(zhì)中，與熱應(yīng)激蛋白(HSPs)結(jié)合，這些HSPs可使GRs維持在無活性的結(jié)構(gòu)。GCs進入細胞并與無活性的GR單體結(jié)合，誘導(dǎo)HSPs分離下來，并激活GRs。隨后被激活的GR單體合并形成活躍的GR二聚體，二聚體以一種能量依賴的形式轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，綁定在MT基因調(diào)節(jié)區(qū)的GREs上，激活MT基因轉(zhuǎn)錄［22］。MT又可激活GR基因表達，二者相互作用［23］。

1.4 M T與炎性應(yīng)激

炎癥、細菌感染等反應(yīng)可強烈誘導(dǎo)MT在肝臟的蓄積［24－25］，這一過程主要是由細胞因子介導(dǎo)的。巨噬細胞釋放白細胞介素－1(IL-1)、白細胞介素－6(IL-6)以及腫瘤壞死因子(TNF-α)，其中IL-6被認為是MT最有力的誘導(dǎo)物［26］。

IL-6與肝臟細胞膜上IL-6受體結(jié)合，致使受體聚集，這些受體簇激活聯(lián)合的Janus激酶(JAK)，活化的JAK使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激酶(STAT)的活化劑磷酸化，活化劑形成二聚體，轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，通過綁定在MT基因調(diào)節(jié)區(qū)的STAT反應(yīng)元件上誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄［27］。

1.5 M T與營養(yǎng)性應(yīng)激

當(dāng)機體處在禁食、饑餓、蛋白質(zhì)－能量營養(yǎng)不良或鋅、鈣缺乏等營養(yǎng)性應(yīng)激狀態(tài)下時，肝臟MT的表達量可受到影響［18，28－30］。在營養(yǎng)性應(yīng)激下，MT的產(chǎn)生機制很復(fù)雜，除了考慮上述GCs、細胞因子以及鋅等因素的介導(dǎo)作用外，胰高血糖素和瘦素也成為關(guān)注的焦點，而試驗結(jié)果表明，二者并不介導(dǎo)在營養(yǎng)性應(yīng)激下 MT 的產(chǎn)生［18，30］。

1998 年 Beattie等［31］試驗發(fā)現(xiàn) MT-null小鼠在7周齡之前出現(xiàn)肥胖癥，表現(xiàn)為體重、白脂肪組織重、肥胖基因表達以及血漿瘦素濃度等增加;22～39周齡時則更加肥胖，出現(xiàn)與肥胖動物模型，如糖尿病小鼠相似的癥狀。這些試驗結(jié)果暗示MT與能量平衡存在某種關(guān)聯(lián)。反過來，能量平衡也可能在一定程度上影響MT的合成。另外，營養(yǎng)性應(yīng)激對生長激素軸的影響［32］早已被證實，這也為研究營養(yǎng)性應(yīng)激下MT的變化機制提供了新的思維視角。

總之，由于MT基因啟動子部位含有多種調(diào)控元件，而一種應(yīng)激反應(yīng)中也可能會涉及其他的應(yīng)激反應(yīng)，通常會表現(xiàn)出一種應(yīng)激綜合征，所以，MT在應(yīng)激反應(yīng)中的相關(guān)調(diào)控是非常復(fù)雜的。另外，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變可能有助于提高MT基因?qū)Ω鞣N誘導(dǎo)物的敏感性［33］，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對MT在各組織的表達量也有影響［34］。

2 M T在應(yīng)激反應(yīng)中的作用

研究表明，內(nèi)源性誘導(dǎo)或外源性補充MT可增強機體對應(yīng)激的耐受力。MT在應(yīng)激反應(yīng)中的作用主要表現(xiàn)在如下幾個方面。

2.1 清除應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的自由基

體內(nèi)常見的抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)等。盡管MT與它們之間的關(guān)系尚不明確，但已有試驗證明，MT清除自由基的能力強于GSH-Px和SOD［35］。MT蛋白約30%的氨基酸是半胱氨酸，含有大量的巰基基團，與GSH-Px相似，它們都是肝臟巰基的主要來源。重要的是，與GSH-Px和其他蛋白相比，MT中的巰基更易受到自由基的攻擊［36］。MT中還原狀態(tài)的巰基具有親核性，其中的金屬具有動力學(xué)不穩(wěn)定性，這使得MT對自由基，如羥自由基(·OH)、超氧自由基(O－2·)或一氧化氮(NO)等具有較強的清除作用。目前已有大量體內(nèi)和體外試驗證實了MT抗氧化損傷的能力［37］。對于重金屬引起的應(yīng)激反應(yīng)，MT除了可以清除自由基，還可直接螯合有毒金屬汞、銀、鉛、鎘、砷、鉻、鎳等，以解除重金屬對機體的毒性。免疫組織化學(xué)研究已經(jīng)證實，在快速增殖細胞的細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，均有MT表達的增加。MT在細胞核內(nèi)貯留的意義還不清楚，但已經(jīng)被認為可能是保護DNA免受氧化損傷或調(diào)節(jié)鋅以供給與細胞分裂有關(guān)的關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子。

近年來，MT與細胞抗凋亡成為研究的一個熱點。研究表明，MT可以保護細胞抵抗由氧化應(yīng)激或重金屬引起的細胞凋亡［38］。2003年，Shimoda等［39］用人類腫瘤細胞系 PLC/PRF/5、H460 和HepG2這3種細胞巧妙地證明，無論是MT基礎(chǔ)表達量還是誘導(dǎo)表達量都與細胞抗凋亡能力有很強的相關(guān)性，MT含量越高，細胞抗凋亡能力越強。但目前MT抵抗細胞凋亡的細微調(diào)節(jié)機制尚不明確。

2.2 調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)中鋅的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)

體內(nèi)具有鋅依賴性的酶有300多種，同時，鋅也是免疫系統(tǒng)的一種必需微量元素。鋅的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)微妙地調(diào)節(jié)著免疫系統(tǒng)。鋅缺乏會使原始T細胞和其他免疫細胞功能受損［40］。當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)下，正常狀態(tài)下的鋅內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打亂，需要一種新的穩(wěn)態(tài)形式來應(yīng)對應(yīng)激對機體的損傷。

而MT是目前公認的與鋅內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有密切關(guān)系的蛋白，素有細胞內(nèi)“鋅池”之稱［3，34］。MT 或MT mRNA已經(jīng)被作為一個敏感指標(biāo)來衡量體內(nèi)鋅的營養(yǎng)狀況［41］。MT通過腸壁黏膜細胞有選擇地決定鋅的吸收。在應(yīng)激狀態(tài)下，MT增加機體從腸道及血液中鋅的吸收與轉(zhuǎn)移，通過調(diào)節(jié)鋅在機體各個組織器官的重新分配來滿足體內(nèi)鋅的平衡，從而及時保護機體重要器官［42］。

2.3 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)

Borghesi等［43］試驗結(jié)果顯示，無論是把 MT單獨添加到脾細胞培養(yǎng)中，還是與T細胞特異分裂素ConA或B細胞特異分裂素脂多糖(LPS)一起添加，MT都可以刺激鼠類淋巴細胞的增殖。這種增殖部分依賴于MT結(jié)合在淋巴細胞質(zhì)膜上。在純化了的T淋巴細胞和B淋巴細胞群中可以觀察到MT在細胞質(zhì)膜上的結(jié)合［43］。

MT還可以促進巨噬細胞的功能。Leibrandt等［44］證明向單核細胞系THP-1中添加LPS，可以導(dǎo)致MT合成減少。而MT產(chǎn)量的降低同時伴隨著THP-1細胞承受LPS誘導(dǎo)的呼吸急促能力的抑制。這表明細胞內(nèi)MT可能促進單核細胞的激活，而隨著MT合成的減少，免疫反應(yīng)在這方面的效力逐漸受到抑制。

MT對體內(nèi)體液免疫也有影響。在MT存在的情況下，用卵清蛋白(OVA)或羊紅血球(sRBC)免疫的小鼠對任意一種抗原其抗體水平都顯著降低。例如，與僅注射OVA的小鼠相比，同時注射OVA和MT的小鼠的循環(huán)血中抗卵清蛋白免疫球蛋白G(IgG)降低了20% ～30%，盡管這2個處理的反應(yīng)動力學(xué)相似。這表明MT對體液免疫起到了免疫抑制作用［45］。

MT介導(dǎo)免疫反應(yīng)產(chǎn)生變化的分子機制有待進一步研究。以上對免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用都基于MT蛋白主鏈上的巰基。如果MT被烷基化或?qū)⑵鋷€基氧化，則刺激淋巴細胞增殖的效應(yīng)就會消失［3］。

3 M T的非保護性功能

盡管MT參與多種應(yīng)激反應(yīng)，具有清除金屬離子、自由基和其他生物學(xué)有毒物質(zhì)的能力，但并非MT的所有功能都是積極的、保護性的。例如，鎘－MT和鋅－MT可以提高遺傳毒性，造成單鏈DNA的損傷［46］。另外，MT還與金屬介導(dǎo)的腎病有關(guān)聯(lián)［47］。同時，MT的過度表達可以使卵巢癌化療產(chǎn)生耐藥性，并與致癌過程有關(guān)［48］。

4 小結(jié)

目前，MT與應(yīng)激的相關(guān)研究以內(nèi)源誘導(dǎo)及其機理性研究較多，很少涉及外源添加MT對應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)這一實踐性問題。再者，研究對象多為嚙齒類活體動物或其體外培養(yǎng)的細胞，在畜禽上的研究卻很少。為了將MT有效地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，積極進行MT與畜禽應(yīng)激，如熱應(yīng)激、長途運輸、仔豬斷奶應(yīng)激等相關(guān)研究顯得很有必要。另外，MT與其他抗應(yīng)激系統(tǒng)的關(guān)系尚不明確。如以往研究顯示，體內(nèi)常見的抗氧化系統(tǒng)(SOD、GSH-Px)及HSPs在應(yīng)激反應(yīng)中都發(fā)揮一定的作用，它們與MT是否發(fā)生于應(yīng)激反應(yīng)的不同階段或發(fā)揮不同的功能?這些問題有待進一步研究。

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