王智航 姜成哲 崔明勛 安尚澤 汪 巖 姜 賀 劉 歡 李洪龍

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000)

腸道菌群的穩(wěn)定是保障犢牛健康的第一道防線，為盡早建立完善的腸道菌群環(huán)境和犢牛免疫系統(tǒng)，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)手段的干預(yù)和調(diào)控是必要的。犢牛出生時(shí)消化道為無(wú)菌環(huán)境，開(kāi)放式接受母源營(yíng)養(yǎng)和抗體，而后隨著穩(wěn)定菌群環(huán)境(菌種、數(shù)目及比例相對(duì)穩(wěn)定)的逐漸建立，功能完善的腸黏膜免疫屏障最終形成。由于這需要一定的時(shí)間和環(huán)境，為病原菌的定植與侵襲提供了機(jī)會(huì)，是犢牛腹瀉等一些疾病的主因。因此以這一時(shí)期的犢牛為研究對(duì)象，是把握犢牛健康和保證生產(chǎn)效益的關(guān)鍵。低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)是益生素的一種，其分子結(jié)構(gòu)一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1～7個(gè)半乳糖基。GOS的原型出現(xiàn)在動(dòng)物的乳汁中，量很少。作用特點(diǎn)是作為選擇性的微生物前體，在腸道中被某些細(xì)菌的β－半乳糖苷酶水解為葡萄糖和半乳糖，作為細(xì)菌復(fù)制與增殖的碳源，從而影響腸道菌群平衡。其益生原理有2種，一是某些病原菌不能利用GOS;二是有益菌利用GOS作為自身增殖的碳源，競(jìng)爭(zhēng)性的阻止了病原菌的定植［1］。邰秀林等［2］采用低聚果糖用于1月齡以后對(duì)犢牛，王喜明等［3］采用低聚木糖用于7日齡以后的犢牛，均有一定效果。而筆者認(rèn)為，犢牛出生至1月齡是腸道菌群定植和穩(wěn)定環(huán)境形成的階段，是腸道調(diào)控的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)查GOS對(duì)初生犢牛糞樣菌群、血液指標(biāo)及生長(zhǎng)性能的影響，探討利用GOS作為犢牛用益生素的效果，并對(duì)犢牛出生后的腸道菌群變化及GOS的機(jī)制做一探討。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

GOS:純度57%，微黃色液體，密度1.462 4 g/mL，購(gòu)自廣東云浮新金山生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取12頭初生重相近，體況良好的新生犢牛，公母各占1/2，按體重和性別隨機(jī)分為3組，每組4頭，于2～29日齡分別日灌服 GOS 0(對(duì)照組)、10(L 組)、15 g/d(H 組)。

犢牛出生后1～2 h保證吃到足夠的初乳。試驗(yàn)進(jìn)行前統(tǒng)一驅(qū)蟲(chóng)。犢牛和母牛在同舍飼養(yǎng)，每天06:00飼喂和灌服GOS。犢牛采用隨母哺乳方式，根據(jù)需要自由哺乳。自由飲水，常規(guī)光照，每次飼喂后，清掃牛舍，保持牛體表的清潔。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糞樣采集與菌落培養(yǎng)

于8、15、22和29日齡晨飼前，刮取犢牛直腸末端糞樣約1 g，裝入滅菌后的離心管，迅速送回實(shí)驗(yàn)室。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g糞樣，用生理鹽水等比稀釋到不同滴度 10－5、10－7、10－9、10－11(根據(jù)培養(yǎng)后的菌落密度調(diào)整)。每個(gè)滴度取200μL，在準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基上涂菌［雙歧桿菌采用BBL培養(yǎng)基、大腸桿菌采用伊紅美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基［4］］。所有操作均在厭氧操作臺(tái)上進(jìn)行的，BBL培養(yǎng)基上涂菌后厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h;EMB培養(yǎng)基涂菌后移至常規(guī)培養(yǎng)箱，有氧環(huán)境37℃培養(yǎng)48 h。用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀(V1型，杭州迅數(shù)科技有限公司)結(jié)合肉眼觀察記錄菌落數(shù)，以lg(CFU/g)表示。

1.3.2 血樣采集與分析

于15和29日齡，于犢牛頸靜脈分別用十二烷基四乙酸二鈉(EDTA)真空管采集血液2 m L、肝素真空管采集2 m L，樣本采集后送到吉林省琿春市醫(yī)院，采用全自動(dòng)五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀(雅培CELL－DYN 3700)測(cè)定紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、平均細(xì)胞容積(MCV)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、血細(xì)胞比容(HCT)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)和紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC);采用全自動(dòng)生化分析儀(雅培C8000)測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性及血清尿素氮(BUN)含量。

1.3.3 生產(chǎn)性能的測(cè)定

于1和29日齡清晨空腹測(cè)定犢牛初生重和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)末重，并計(jì)算平均日增重。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和單因素方差分析，差異顯著者用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 GOS對(duì)糞樣菌群的影響

由表1可知，對(duì)照組犢牛糞樣大腸桿菌數(shù)較為穩(wěn)定，8～29日齡內(nèi)無(wú)顯著變化(P＞0.05)，為9.58～10.46 lg(CFU/g);各試驗(yàn)組隨日齡增加，大腸桿菌數(shù)先增加后減少，22日齡為最高;L組隨日齡的變化顯著(P＜0.05)，H組變化相對(duì)緩慢;22日齡各試驗(yàn)組大腸桿菌數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，其他各日齡對(duì)照組與試驗(yàn)組均差異不顯著(P＞0.05);29日齡對(duì)照組和L組大腸桿菌數(shù)最低，2組間差異不顯著(P＞0.05)。

對(duì)照組雙歧桿菌數(shù)隨日齡增加而增多，變化范圍7.28 ～10.15 lg(CFU/g)，22 日齡以后差異顯著(P＜0.05);各試驗(yàn)組犢牛在各日齡雙歧桿菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且均為22日齡達(dá)到最高;L組雙歧桿菌數(shù)高于其他2組。

2.2 GOS對(duì)血液生理指標(biāo)的影響

由表2可知，犢牛出生后隨日齡增加RBC、HGB、MCHC降低，MCV、RDW、MCH 增加;L組15和29日齡、H組29日齡RBC顯著低于對(duì)照組(P ＜0.05);MCV 不受處理的影響(P ＞0.05)，隨日齡增加，L組和對(duì)照組MCV顯著增加(P＜0.05);RDW 不受處理的影響(P＞0.05)，H 組和對(duì)照組RDW 隨日齡顯著增加(P＜0.05);HGB的變化趨勢(shì)類(lèi)似于RBC，15日齡L組顯著低于對(duì)照組和H組(P＜0.05)，29日齡顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);MCHC 15日齡 H組、29日齡 L組和H組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3 GOS對(duì)血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，試驗(yàn)期內(nèi)AST活性和BUN含量均不受處理和日齡變化的影響(P＞0.05);ALT活性隨日齡增加對(duì)照組和L組均顯著增強(qiáng)(P＜0.05)，29日齡L組顯著高于 H 組(P＜0.05)。

表1 GOS對(duì)犢牛糞樣大腸桿菌和雙歧桿菌數(shù)的影響Table 1 Effects of GOS on the numbers of Escherichia coli and Bifidobacteria in fecal in calves lg(CFU/g)

表2 GOS對(duì)犢牛血液生理指標(biāo)的影響Table 2 Effects of GOS on blood physiological indices of calves

表3 GOS對(duì)犢牛血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of GOS on serum biochem ical indices of calves

2.4 GOS對(duì)犢牛生產(chǎn)性能的影響

由表4可知，犢牛初生重差異不顯著(P＞0.05);末重、平均日增重均為L(zhǎng)組最高，顯著高于對(duì)照組(P ＜0.05)。

表4 GOS對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響Table 4 Effects of GOS on grow th performance of calves

3 討論

3.1 GOS對(duì)犢牛糞樣菌群的影響

犢牛消化道出生時(shí)為無(wú)菌環(huán)境，在出生的過(guò)程中細(xì)菌即開(kāi)始定植，接種物多數(shù)來(lái)自于母畜產(chǎn)道和糞便，部分來(lái)自于外源環(huán)境。首先被轉(zhuǎn)移接種到犢牛的是兼性菌，如大腸桿菌、鏈球菌屬，這些非營(yíng)養(yǎng)性的細(xì)菌通過(guò)生長(zhǎng)耗氧制造出腸道內(nèi)嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，從而提供了營(yíng)養(yǎng)性厭氧菌的生存條件［5］。通過(guò)本試驗(yàn)對(duì)照組數(shù)據(jù)可知，8日齡犢牛腸道中大腸桿菌數(shù)即達(dá)到了10.32 lg(CFU/g)，并在29日齡內(nèi)變化不大;而雙歧桿菌數(shù)8日齡遠(yuǎn)低于大腸桿菌數(shù)，并逐漸增多，22日齡后保持較穩(wěn)定的數(shù)值，與前人研究一致。

腸道微生物區(qū)系的早期發(fā)育很大程度上依賴(lài)于攝取的食物。GOS的原型出現(xiàn)在動(dòng)物的乳汁中，量很少，由乳腺合成，商品GOS則是聚合度不同的混合物。

GOS水解機(jī)制是細(xì)菌依靠自身的β－半乳糖苷酶將GOS水解，β－半乳糖苷酶與半乳糖基以共價(jià)鍵結(jié)合，并將半乳糖基轉(zhuǎn)移給水，1分子的半乳糖被水解下來(lái)，GOS聚合度降低(乳糖降解產(chǎn)物為半乳糖和葡萄糖)［6－7］，最終形成的單糖進(jìn)入小腸上皮，再進(jìn)入血液參與機(jī)體代謝。

細(xì)菌增殖及GOS利用的選擇性決定于2方面:一是該菌種是否有水解GOS的β－半乳糖苷酶，多數(shù)研究認(rèn)為GOS不能使大腸桿菌增殖，大腸桿菌在乳糖上生長(zhǎng)數(shù)千個(gè)酶的分子［7］，鑒于水解的相同機(jī)制，GOS可能也誘導(dǎo)了β－半乳糖苷酶分子的增加;二是聚合度，與聚合度為2的GOS或乳糖相比，聚合度為3或4的GOS更容易被雙歧桿菌利用，所有的雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬能夠利用聚合度為2的GOS［8］。商品GOS成分較為不均一，是聚合度不同的混合物，在這樣的混合物中，對(duì)微生物前體的增加歸因于某一種糖的結(jié)構(gòu)仍存在困難［9］。但這是局限于生產(chǎn)技術(shù)的，控制產(chǎn)品的聚合度、改進(jìn)工藝及降低成本是實(shí)際生產(chǎn)中仍需改進(jìn)的。

人食用GOS后盲腸中乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著增加，大腸桿菌數(shù)量顯著降低［10］。而擬桿菌屬(包括雙歧桿菌和乳酸菌等)和大腸桿菌是最具免疫原性的共生菌［11］。因此，GOS是否能夠使大腸桿菌增殖存在爭(zhēng)議。

犢牛的腸道處于發(fā)育過(guò)程，應(yīng)將微生物共生、競(jìng)爭(zhēng)以及環(huán)境變化作為整體來(lái)研究。本試驗(yàn)中大腸桿菌數(shù)在8日齡試驗(yàn)組均低于對(duì)照組，而在15、22和29日齡均高于對(duì)照組，可能的原因有2方面:一是GOS可以被大腸桿菌所利用，所以出現(xiàn)22日齡前數(shù)量的增加;二是犢牛時(shí)期腸道非嚴(yán)格厭氧環(huán)境制約了雙歧桿菌的生長(zhǎng)，而GOS被大腸桿菌等所利用，22日齡到達(dá)厭氧環(huán)境后，雙歧桿菌的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)才顯現(xiàn)出來(lái)。29日齡試驗(yàn)組雙歧桿菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組，而使大腸桿菌數(shù)保持在和對(duì)照組無(wú)顯著差異。表明GOS改善了腸道菌群平衡，使雙歧桿菌在數(shù)量有顯著提高，并在比例上成為優(yōu)勢(shì)菌群。

3.2 GOS對(duì)犢牛血液指標(biāo)及生長(zhǎng)性能的影響

血液組分的變化是考察犢牛的健康和福利水平的標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于犢牛出生后的紅細(xì)胞及其組分的變化前人得出了較為一致結(jié)果:1周齡開(kāi)始犢牛RBC和 HGB降低［12］，且 HGB隨 MCHC降低而降低［13］。觀察對(duì)照組結(jié)果得出的規(guī)律如下:單位體積內(nèi)，隨日齡增加紅細(xì)胞數(shù)量減少(RBC降低)、體積(MCV)增大、大小逐漸不一致(RDW 升高);由于細(xì)胞濃度的降低，單位體積內(nèi)的血紅蛋白含量(HGB)及其在紅細(xì)胞中的濃度(MCHC)也隨之降低，而單個(gè)紅細(xì)胞中血紅蛋白含量(MCH)增加。

紅細(xì)胞數(shù)目減少和組分變化會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物貧血。血液通過(guò)肺時(shí)紅細(xì)胞通過(guò)血紅蛋白攜帶氧，隨氧釋放到全身的組織和器官。幼年動(dòng)物易發(fā)貧血，對(duì)照組中RBC和HGB減少均表明犢牛即將面臨或正在面臨這樣的危機(jī)，據(jù)Bomba等［14］報(bào)道犢牛貧血臨界期為3～5周齡，原因是較高的生長(zhǎng)速度和造血底物的不足間的不平衡。

生長(zhǎng)期的犢牛血液指標(biāo)受飼糧和飼養(yǎng)管理的影響很大［15］。犢牛灌服GOS的作用結(jié)果是:RBC和HGB降低(其中 L組顯著低于對(duì)照組，P＜0.05)，MCHC 顯著提高了(P ＜0.05)。RBC 和HGB的變化可能同樣是由于較高的生長(zhǎng)速度引起的，可以從生長(zhǎng)性能的試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組得到佐證;而MCHC的升高推測(cè)是GOS引發(fā)的效果，機(jī)制尚不清楚，但可以說(shuō)明單個(gè)紅細(xì)胞攜氧能力顯著提高。MCHC 值為25.70～37.33 g/dL，與Bam i等［16］報(bào)道荷斯坦?fàn)倥５闹到咏?。本試?yàn)中灌服GOS的犢牛，更易面臨RBC少和HGB低型的貧血，但單個(gè)紅細(xì)胞的攜氧能力有所提高，可緩解該型貧血。

ALP是用于診斷骨和肝功能紊亂的膜結(jié)合酶，成骨細(xì)胞活性，生長(zhǎng)動(dòng)物的ALP活性顯著高，因此在幼齡動(dòng)物中，ALP活性高低可以反映出動(dòng)物的生長(zhǎng)快慢，本試驗(yàn)中L組為最高，與生長(zhǎng)性能L組最好相一致。

BUN可以反映動(dòng)物蛋白質(zhì)代謝，GOS飼喂?fàn)倥UN含量增加，但差異不顯著，可能是由于GOS在腸道內(nèi)使有益菌增值，菌體蛋白含量增加，而等于增加了動(dòng)物吸收的蛋白質(zhì)源。

犢牛飼喂GOS后提高了末重和平均日增重。從各項(xiàng)數(shù)據(jù)剖析這一結(jié)果，應(yīng)該是GOS優(yōu)化了腸道菌群，使雙歧桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌，而雙歧桿菌發(fā)揮其作為益生菌的作用，引發(fā)犢牛機(jī)體的生理及免疫功能的變化，最終提高了犢牛的生長(zhǎng)性能。L組生長(zhǎng)性能最好，可能是由于高劑量GOS不能完全被利用，β－半乳糖苷酶的底物將其合成了更高聚合度的GOS，導(dǎo)致利用率的降低，同L組菌群作用效果最佳相印證，與生理生化指標(biāo)變化相一致。

綜合以上，GOS可以改善犢牛腸道菌群環(huán)境，使雙歧桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度，但也因高生長(zhǎng)速度引發(fā)造血原料的不足而使動(dòng)物更易貧血。

本試驗(yàn)采用完全隨母哺乳的飼喂方式，以考察GOS單因素的作用效果，而在實(shí)際生產(chǎn)中如采用營(yíng)養(yǎng)更為全面的代乳粉，通過(guò)外源補(bǔ)充方式可以避免本試驗(yàn)中的造血原料的不足。

4 結(jié)論

①初生犢牛飼喂GOS可影響腸道菌群平衡，使雙歧桿菌成為腸道優(yōu)勢(shì)菌。

②初生犢牛飼喂GOS可提高生長(zhǎng)速度，而相對(duì)的造血原料的不足加重，但可以緩解低MCHC型貧血的發(fā)生。

③在本試驗(yàn)條件下，添加10 g/d效果較好。

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