李燕利 胡春祥 高佳

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

分月扇舟蛾(Clostera anastomosis L.)屬鱗翅目，舟蛾科，是我國廣大林區(qū)常發(fā)生的一種林木蟲害。全國各地林區(qū)均有發(fā)生，在東北地區(qū)的闊葉次生林及人工林內較為常見。主要危害山楊及其它楊、柳類樹木。近幾年，分月扇舟蛾蟲害屢有發(fā)生，且危害嚴重［1］，常大面積爆發(fā)成災，嚴重影響樹木的生長和生態(tài)效益的發(fā)揮［2］。

Bt是一種對人畜安全、無環(huán)境污染的微生物殺蟲劑，在農、林害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用［3］。關于Bt殺蟲蛋白對昆蟲的作用機制大多數(shù)研究主要集中在昆蟲組織病理學觀察和殺蟲蛋白與中腸上皮細胞膜之間的結合作用上，對昆蟲的保護酶活性影響的研究報道則相對較少。保護酶是昆蟲體內最主要的三大酶系之一，已有報道證實Bt引起昆蟲的保護酶系變化［4－5］。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)是生物體內普遍存在的3種防御氧化損傷的重要保護酶。SOD的作用是把O－2·歧化成H2O2，H2O2能與O－2·形成毒性更強的氫氧自由基(HO·)，但細胞內的CAT可以將H2O2轉化成水，生物體內的幾種保護酶處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個低水平，起到保護生物機體的作用［6］。一旦保護酶系遭到破壞，導致機體內氧自由基濃度過高，自由基超強的氧化能力將破壞生物功能分子機制，使細胞功能受到威脅［7］。國內外關于Bt殺蟲蛋白對昆蟲的作用機制大多數(shù)研究主要集中在昆蟲組織病理學觀察和殺蟲蛋白與中腸上皮細胞膜之間的結合作用上，對昆蟲的保護酶活性影響的研究只見于轉基因作物方面［8－10］，而對鱗翅目的林業(yè)害蟲保護酶系影響的研究還未見報道，因此，本研究從抗氧化防御角度研究Bt對分月扇舟蛾幼蟲體內保護酶活性的影響，對于深入了解Bt對鱗翅目昆蟲的作用機理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

分月扇舟蛾采自黑龍江省大慶市杜爾伯特蒙古族自治縣新店林場，采后在室內飼養(yǎng)1 d，用毛筆挑取齡期大小一致的幼蟲進行毒力和酶活力測定。

1.2 毒力測定

采用葉片藥膜法，將Bt粉劑用蒸餾水配成50.0、10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 ng·L－1，以蒸餾水處理作對照。將未接觸過藥劑的楊樹葉片在稀釋藥液中浸10 s，陰干，用蘸有充足水分的脫脂棉裹住葉柄，放入透氣性良好的透明養(yǎng)蟲瓶(直徑9 cm、高14 cm)中。挑選分月扇舟蛾5齡幼蟲接到楊樹葉片上，每瓶放入15頭，重復4次。置于溫度為(28±0.5)℃，光周期12 h/d的恒溫養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)。每隔1～2 d換1次葉片，換葉片時把幼蟲的糞便清理干凈，分別于12、24、36、48、72 h后檢查死亡數(shù)。用毛筆輕觸幼蟲，對刺激物無反應者視為死亡。數(shù)據(jù)用POLO軟件處理，計算LC30、LC50及其95%置信區(qū)間。

1.3 酶活性測定

酶液制備:根據(jù)室內毒力測定結果，選擇48 h的LC30(9 ng·L－1)和LC50(17 ng·L－1)2個質量濃度劑量處理分月扇舟蛾5齡幼蟲，在12、24、48、72 h后取健壯、活潑的幼蟲5頭，加入5 mL 0.05 mol·L－1，pH值7.0預冷的磷酸緩沖液(含1%PVP、0.04%苯基硫脲和0.01 mol·L－1EDTA)，冰浴下充分勻漿后，于4℃，10 000 r/min下離心15 min，取上清液為待測酶液。

超氧化物歧化酶測定:參考Beauchamp等［11］方法。在試管中加入3 mL反應液(含50 mmol·L－1，pH=7.0磷酸緩沖液，13 mmol·L－1甲硫氨酸，10 mmol·L－1EDTA，75 mmol·L－1NBT)和0.01 mL酶液，最后加入0.4 mmol·L－1核黃素0.6 mL，以不加酶液管作為最大光還原管，4 000 lx下光照20 min后，立即避光，迅速測定A560值，以未光照的相同反應管為對照管，50%抑制率所需的酶量為一個酶活性單位(U)，測定重復3次，計算SOD酶活性，酶活力單位以U·min－1·mg－1表示，每處理重復3次。

過氧化氫酶測定:取30%H2O20.5～0.6 mL，加水至50 mL，從中取出4 mL，加入0.05 mol·L－1磷酸緩沖液(pH值7.0)26 mL，測定240 nm處1 cm光路OD值，如其OD值在0.50～0.55，即作為過氧化氫酶的底物溶液，取已預溫至25℃的底物溶液3 mL，在25℃條件下加入粗酶液30 μL，立即用紫外分光光度計在240 nm下每隔30 s測定一次，記錄2 min。酶活力單位以U·min－1·mg－1表示，每處理重復3次。

過氧化物酶測定:參考Simon［12］方法。在試管中分別加入0.1 mol·L－1、pH值6.0的磷酸緩沖液1.8 mL，0.1%愈創(chuàng)木酚1 mL，酶液0.05 mL和0.08%H2O21 mL，混勻后，反應20 min，以蒸餾水為對照，于470 nm處測定OD值。酶活力單位為U·min－1·mg－1。

蛋白含量測定:參照Bradford［13］記述的考馬斯亮蘭藍G－250染色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用POLO軟件計算Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲的LC30、LC50及95%置信區(qū)間。對同一質量濃度處理下不同時間對酶活性影響的差異采用SPSS16.0軟件LSD方法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 Bt對分月扇舟蛾幼蟲的毒力

Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲的毒力測定結果如表1所示:LC30和LC50隨著處理時間的增長而逐漸減小，其中36 h LC30是48 h的2.876倍，72 h LC30是48 h的1.526倍;36 h LC50是48 h的4.539倍，72 h LC50是48 h的1.469倍。說明隨著處理時間的增加，Bt對分月扇舟蛾幼蟲的毒力增強。

表1 Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲的毒性

2.2 Bt對分月扇舟蛾SOD的影響

Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲體內SOD的影響見表2。與對照相比，9 ng·L－1的Bt處理后，分月扇舟蛾體內的SOD活性呈平緩的趨勢增加，分別增加了5.8%、10.0%、14.1%、19.9%，但均無顯著差異。這說明較低質量濃度的Bt對分月扇舟蛾體內的SOD活性有激活作用，只是隨著處理時間的增加，對SOD活性的激活作用不明顯，這可能是較低質量濃度的Bt并沒有對分月扇舟蛾幼蟲造成很大的傷害。17 ng·L－1的Bt處理后，SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在48 h時達到最大值，為對照的1.704倍，而后開始下降，但均高于對照，24、48、72 h表現(xiàn)為差異極顯著(p＜0.01)。說明在處理12～48 h分月扇舟蛾體內超氧自由基數(shù)量大增，使SOD活性增加，但是隨著處理時間的增大，過量的超氧自由基使SOD活性受到抑制，以致在72 h時，SOD的活性有所降低。SOD酶活性:LC50＞LC30＞CK。Bt質量濃度越高，對SOD酶活性的激活作用越大。而2種處理都在48 h時達到最大值，72 h出現(xiàn)下降的趨勢，說明隨處理時間增長，分月扇舟蛾體內積累的Bt抑制了SOD清除體內產生的O－2·，因而導致其中毒。

表2 Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲SOD活性的影響

2.3 Bt對分月扇舟蛾CAT的影響

由表3可見，9 ng·L－1的Bt處理后，CAT活性呈明顯的上升趨勢，并在72 h時達到最大值。在48、72 h的CAT活性升高顯著，分別是對照的1.238、1.307倍，并表現(xiàn)出差異極顯著(p＜0.01)。17 ng·L－1的Bt處理后，各處理時間的CAT酶活性均略高于對照但變化平緩，分別比對照增加了8.4%、8.7%、3.0%、5.6%，只有在處理24 h后，達到差異顯著(p＜0.01)。

表3 Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲CAT活性的影響

CAT活性高于對照組，這可能是清除由免疫反應產生的大量自由基的需要。9 ng·L－1處理組與17 ng·L－1處理組相比，CAT酶活性增加了，可能是低質量濃度的Bt能夠激活CAT，提高了體內清除H2O2的能力，而當Bt的質量濃度過大時，超過了機體所能承受的閾值，不能激活CAT，酶活性變化水平不大，不能主動清除體內產生的H2O2，從而對分月扇舟蛾產生毒害作用。

2.4 Bt對分月扇舟蛾POD的影響

Bt對分月扇舟蛾POD的影響見表4。取食9 ng·L－1的Bt后，在處理72 h中，分月扇舟蛾體內POD活性呈顯著上升的趨勢，且各處理時間的POD活性與對照相比，差異均極顯著(p＜0.01)，在各時間段的酶活性分別是對照的2.789、3.432、1.277、8.077倍，在72 h時達到最高值。取食17 ng·L－1的Bt后，POD活性不斷升高，并均高于對照，在處理12、24 h時POD活性呈平緩的上升趨勢，而在48、72 h時有顯著升高，并表現(xiàn)出差異極顯著(p＜0.01)，分別是對照的3.014、3.165倍。

POD主要作用是清除生物體內代謝后期的有害物質。由此可見，隨著取食時間的推移，分月扇舟蛾體內的POD顯著升高，說明其抵抗Bt脅迫的能力強，能夠提高自身體內的POD活性以清除體內過量的H2O2，維持細胞內H2O2的平衡，從而適應外界環(huán)境。

表4 Bt對分月扇舟蛾5齡幼蟲POD活性的影響

3 結論與討論

昆蟲保護酶系活性與殺蟲劑、昆蟲病毒、微孢子蟲等外界刺激物的強度及昆蟲耐藥性和抗逆性等相關［6，14－16］。研究表明，昆蟲體內存在著超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等保護酶系統(tǒng)，在昆蟲各種生理作用或生化反應過程中起著清除氧自由基、保護昆蟲機體免受損傷的重要作用［17］。本研究中分月扇舟蛾幼蟲取食不同質量濃度Bt處理的楊樹葉片后，體內保護酶活性的增加，可以認為是一種保護性的反應，保護酶活性的增加意味著清除自由基的能力加強，即表現(xiàn)出一定的抗逆性能力。分月扇舟蛾幼蟲取食不同質量濃度Bt后體內保護酶活性受到誘導增加和國內很多研究結果類似。郭建英等［10］研究甜菜夜蛾幼蟲取食Bt棉后，體內總超氧化物酶活力顯著高于取食常規(guī)棉相同時間的個體。申繼忠等［18］報道大蠟螟(Galleria mellonella)幼蟲取食蘇云金桿菌后SOD的活性顯著升高;Ding Shuangyang等［8］研究了轉Bt基因歐洲黑楊(Populus nigra)和轉CpTI基因毛白楊(P.tomentosa×P.bolleana)×P.tomentosa對美國白蛾(Hyphantria cunea)幼蟲中腸保護酶(SOD、CAT和POD)活性的影響，結果表明害蟲取食轉基因楊樹后，中腸SOD、CAT和POD在飼喂數(shù)小時內均逐漸增加，在某一時刻達到最高值后突然下降。郭同斌等［9］研究了轉基因楊樹對楊小舟蛾體內3種保護酶活力的影響，結果顯示幼蟲中腸SOD活力顯著升高，而CAT和POD活力受到了顯著抑制。

分月扇舟蛾幼蟲體內保護酶活性增加是一種保護性的反應，但3種酶活在不同的劑量水平體現(xiàn)出的活性變化并不一致。9 ng·L－1的Bt處理后，分月扇舟蛾幼蟲體內SOD活性無明顯變化趨勢，而CAT和POD活性呈顯著上升趨勢，可能是分月扇舟蛾幼蟲體內SOD對低質量濃度Bt的脅迫不敏感，而CAT和POD較為敏感。CAT和POD活性的增大可以加速清除體內積累過多的自由基以減少對分月扇舟蛾的傷害。17 ng·L－1的Bt處理后，分月扇舟蛾幼蟲體內在短時間內積累大量的超氧陰離子自由基(O－2)，誘導SOD活性在12～48h明顯升高，將過多的超氧陰離子自由基(O－2)轉化成H2O2，進而誘導了CAT和POD的活性增大來清除體內過多的H2O2，而在72 h時，SOD的活性受到抑制，這可能是由于H2O2在體內的大量積累，導致H2O2與O－2·形成毒性更強的氫氧自由基(HO·)，破壞了細胞功能與結構，使分月扇舟蛾中毒。

藥劑處理對昆蟲活性氧代謝系統(tǒng)造成的影響是很復雜的，采用不同劑量可能會得到不同的結果。在正常狀況下分月扇舟蛾體內SOD、CAT和POD協(xié)調一致、處于動態(tài)平衡狀態(tài)，使得自由基處于一個低水平。當分月扇舟蛾受到低質量濃度的Bt脅迫時，SOD活性變化不顯著，可能此階段尚未產生過多的活性氧來激活SOD，而CAT和POD活性的增大可以清除體內積累的自由基，以減少對分月扇舟蛾的傷害，這說明低質量濃度Bt處理時，分月扇舟蛾體內3種保護酶處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個低水平［6］;高質量濃度Bt的脅迫，SOD活性顯著升高但在48 h達到最大值后下降，說明高質量濃度的Bt處理在短時間內激活了SOD活性，將過多的超氧陰離子自由基(O－2)轉化成H2O2，而CAT活性增加趨勢不明顯，POD也只在48、72 h時有顯著升高，不能及時清除大量的H2O2，而導致過高濃度的H2O2在48 h達到最大值后開始抑制SOD的活性，說明高質量濃度Bt處理使得分月扇舟蛾體內3種保護酶表現(xiàn)出不同的增降趨勢，破壞了3種酶的平衡關系，導致細胞內自由基水平過高對蟲體產生了不可恢復的毒害作用［7］。

［1］蘇元吉，高玉梅.分月扇舟蛾發(fā)生特點及防治探析［J］.林業(yè)科技情報，2009，41(3):8－9.

［2］王福維，牛延章，侯麗偉，等.分月扇舟蛾生物學特性及其防治研究［J］.林業(yè)科學研究，1998，11(3):325－329.

［3］譚聲江，陳曉峰，李典謨.昆蟲對Bt毒素的抗性機理研究進展［J］.昆蟲知識，2001，38(1):12－17.

［4］徐艷聆，王振營，何康來，等.轉Bt基因抗蟲玉米對亞洲玉米螟幼蟲幾種主要酶系活性的影響［J］.昆蟲學報，2006，49(4):562－567.

［5］張巍，張志罡，付秀芹，等.轉Bt基因水稻對稻縱卷葉螟幼蟲體內三種保護酶活性的影響［J］.昆蟲學報，2008，51(10):1022－1027.

［6］李周直，沈惠娟，蔣巧根，等.幾種昆蟲體內保護酶系統(tǒng)活力的研究［J］.昆蟲學報，1994，37(4):399－403.

［7］張慧，王曉容，匡石滋，等.斜紋夜蛾核型多角體病毒與兩種亞致死劑量的農藥混用對斜紋夜蛾體內三種抗氧化酶活性的影響［J］.昆蟲學報，2006，49(5):775－779.

［8］Ding Shuangyang，Li Huaiye，Li Xuefeng，et al.Effects of two kinds of transgenic poplar on protective enzymes system in the midgut of larvae of American white moth［J］.Journal of Forestry Research，2001，12(2):119－122.

［9］郭同斌，嵇保中，蔣繼宏，等.轉基因楊樹對楊小舟蛾體內三種保護酶活力的影響［J］.昆蟲學報，2006，49(3):381－386.

［10］郭建英，吳剛，萬方浩.甜菜夜蛾體內代謝耐受性對轉Bt基因棉響應的時間動態(tài)［J］.中國科學C輯:生命科學，2009，39(10):940－947.

［11］Beauchamp C，F(xiàn)ridovich I.Superoxide dismutase:improved assays and an assay applicable to acrylamide gels［J］.Analytical Biochemistry，1971，44(1):276－287.

［12］Simon L M，F(xiàn)atrai Z，Jonas D E，et al.Study of peroxide metabolism enzymes during the development of phaseolus vulgris［J］.Biochemistry Physiology，1974，166:387－392.

［13］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72(1/2):248－254.

［14］蔣志勝，尚稚珍，萬樹青，等.光活化殺蟲劑α－三噻吩的電子自旋共振分析及其對庫蚊保護酶系統(tǒng)活性的影響［J］.昆蟲學報，2003，46(1):22－26.

［15］Wang Ying，Oberley L W，Murhammer D W.Evidence of oxidative stress following the viral infection of two Lepidopteran insect cell lines［J］.Free Radical Biology and Medicine，2001，31(11):1448－1455.

［16］Lozinskaya Y L，Slepneva I A，KhramtsovV V，et al.Changes of the antioxidant status and system of generation of free radicals in hemolymph of Galleria mellonella larvae at microsporidiosis［J］.Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology，2004，40(2):119－125.

［17］王滿囷，李周直.滯育期間鞭角華扁葉蜂保護酶系統(tǒng)活力［J］.林業(yè)科學，2002.38(4):100－104.

［18］申繼忠，錢傳范.亞致死劑量蘇云金桿菌蠟螟亞種對大蠟螟幼蟲SOD和POX活性的影響［J］.生物防治通報，1994，10(3):118－122.