王 李,劉長劍,羅宗鍵

(1.大連市友誼醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科,遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,遼寧 大連 116011;3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科,吉林長春 130021)

p38MAPK在低能 ESW和間歇 rhPTH1-34促進 ROB成骨的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用

王 李1,劉長劍2,羅宗鍵3

(1.大連市友誼醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科,遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科,遼寧 大連 116011;3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科,吉林長春 130021)

[目的]探討低能體外沖擊波(ESW)和間歇人重組甲狀旁腺素(rhPTH 1-34)刺激引起的體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞(ROB)成骨的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中 p38MAPK的作用。[方法]分別用有效的低能ESW刺激和間歇 rhPTH 1-34作用于 ROB,并設(shè)立加入 p 38MAPK抑制劑 SB203580組,來觀察 ROB增殖、成骨指標(biāo)及 Western Blot檢測的p38MAPK磷酸化激活變化。[結(jié)果]p38MAPK抑制劑 SB203580能明顯抑制 120次 0.18m J/mm2ESW刺激引起的ROB細(xì)胞增殖和成骨作用(P＜0.05);但不能明顯抑制 10-11mol/L間歇rhPTH 1-34刺激引起的體外培養(yǎng) ROB細(xì)胞增殖及成骨作用(P＞0.05)。ESW應(yīng)力刺激可促進 p-p38MAPK表達,但間歇 rhPTH 1-34不能促進 pp38MAPK表達。[結(jié)論]適當(dāng)?shù)腅SW應(yīng)力刺激可通過激活p 38MAPK促進體外培養(yǎng)ROB增殖和成骨;但p38MAPK并不參與 10-11mol/L間歇 rhPTH 1-34刺激引起的 ROB細(xì)胞增殖和成骨的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

成骨細(xì)胞;體外沖擊波;rhPTH 1-34;p38MAPK

現(xiàn)已知多種理化因素能參與影響體內(nèi)、外成骨過程的各個環(huán)節(jié),各種因素在此過程中并非只是單獨調(diào)節(jié)骨形成或骨吸收,而是對骨吸收和骨形成在不同的組織、不同的時間段起不同的作用,經(jīng)綜合、交叉作用后共同完成對成骨的調(diào)節(jié)。體外沖擊波(extracorporeal shock wave,ESW)和甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)對成骨細(xì)胞的作用引人注目。ESW可以一種機械能的形式進入骨折部位,骨組織對高頻率、低強度的機械刺激敏感,而低能量的 ESW正好可持續(xù)給予骨折部位的骨組織這種應(yīng)力刺激;大量研究證明,頻率、能量強度適合的 ESW可促進骨愈合[1,2]。PTH是成骨調(diào)節(jié)的重要因素,連續(xù)給予較高劑量 PTH可使實驗動物破骨細(xì)胞數(shù)量和活性增加,促進骨吸收;而周期性低劑量給予PTH可使動物活體成骨作用增加[3,4]。但是,ESW和PTH作用的信號機制并不清楚。研究表明,p38MAPK參與多種細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),本研究對 p38MAPK是否參與 ESW和間歇rhPTH1-34促進體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞(ROB)增殖、成骨的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行了探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：出生 24 h內(nèi) Wistar大鼠乳鼠(大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,雌雄不拘,清潔級)每次取 6只大鼠乳鼠顱骨消化分離成骨細(xì)胞,分瓶培養(yǎng)、擴增進行實驗。

1.1.2 試 劑：PI染液、RNA酶(北京鼎國生物技術(shù)公司),ALP活性檢測試劑盒(南京建成公司),高糖 DMEM培養(yǎng)基(美國 Hyclone公司),胎牛血清(杭州四季青公司),SB203580(美國 sigma生物),細(xì)胞全蛋白提取試劑盒(凱基生物),蛋白定量試劑盒(凱基生物),磷酸化 P38 MAPK一抗(美國 Santa Cruze生物),ECL放射顯影試劑盒(美國 Amershan生物),其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備：體外沖擊波碎石機(MODELKDE-2001A,北京中科建安公司),流式細(xì)胞儀(B.D.FACSAria,美國 B.D.公司),恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(SeriesⅡ Waterern Jacketed CO2Incubator,美國 Thermo Electron公司),超凈工作臺 (Forma ClassⅡ A2 Biological Safety Cabinet,美國 Thermo E-lectron公司),立式滅菌器 (LMQ.R-4060,山東新華醫(yī)療儀器公司),Western Blot放射顯影曝光暗室及洗片機,電泳儀(EC120 Mini Vertical Gel System,美國 Thermo Electron)。

1.2 實驗方法

細(xì)胞培養(yǎng),參見作者以前報道的方法[5]。簡要程序如下：取出生 24 h內(nèi) Wistar大鼠乳鼠,浸泡于75%酒精中 5～10min,在超凈工作臺中取出顱骨,仔細(xì)刮除表面附著的軟組織,剔除骨縫之間軟骨,用128 U/mL慶大霉素浸泡沖洗骨塊 3次,用 DHank's液沖洗 2次,至骨塊發(fā)白透亮,置于另一無菌平皿中;用 0.1%I型膠原酶覆蓋骨塊,消化 20 min,吸棄上清及消化掉的細(xì)胞,用眼科手術(shù)剪將骨塊剪碎至 1 mm3甚至更小,加入 0.1%I型膠原酶消化 30m in,透過紗布吸取消化液,移至裝有 DMEM的離心管中終止消化,再次加入 0.1%I型膠原酶消化 30 min,重復(fù)消化共 3次。將獲得的細(xì)胞用 DHank's液洗 2次,懸浮于含 10%胎牛血清的DMEM中,調(diào)整細(xì)胞濃度至 104～105個 /m L,接種于中培養(yǎng)瓶中(視細(xì)胞數(shù)目一般可接種 2～3瓶),置 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3～5 d換液,細(xì)胞長致融合狀態(tài)時消化傳代(1∶2)。

1.2.1 刺激方式及分組：取體外培養(yǎng)第 3代 ROB,刺激之前將 ROB培養(yǎng)于不含血清的培養(yǎng)基中 24 h,使培養(yǎng)的細(xì)胞同步化,然后更換含去類固醇血清的培養(yǎng)基。

10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激方式：在每24 h的前 8 h刺激,共循環(huán) 2個 24 h。ESW刺激方式：將 MODEL KDE-2001體外液波碎石機調(diào)整形成能量密度為 0.18m J/mm2的低能沖擊波。將目標(biāo)細(xì)胞裝入細(xì)胞凍干瓶中,然后通過 C型臂 X射線透視裝置將凍干瓶定位在半橢圓形的第 2焦點處,用該能量的沖擊波分別作用含有 ROB細(xì)胞懸液(5×105/m L)的細(xì)胞凍存管 120次(劑量參照作者前部分實驗已經(jīng)發(fā)表的論文)[5],每組設(shè) 3個樣本。

分組：

1.2.2 MTT(噻唑蘭)法檢測細(xì)胞增殖：分組刺激后,將細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%去類固醇 FBS的高糖DMEM中 48 h;然后將培養(yǎng)液棄去,每孔加入 MTT應(yīng)用液 20μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,每孔加入 150μL二甲基亞砜(DMSO)孵育 20 min。調(diào)整酶標(biāo)儀波長為490 nm,測定每孔吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進行 DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(shù)：取第 3代成骨細(xì)胞,分組刺激后,培養(yǎng)于含 10%去類固醇 FBS的高糖 DMEM中 24 h。收集細(xì)胞,離心棄培養(yǎng)液,70%乙醇固定,置 4℃冰箱過夜。檢測前加 RNA酶溶解 RNA,加 PI染液,避光孵育 30 min,按試劑盒說明上機檢測。用 Modfit分析軟件分析圖像,得出處于各個細(xì)胞周期的細(xì)胞比例,計算 ROB細(xì)胞增殖指數(shù)(PI指數(shù))：PI=S%+G2%。

1.2.4 酶標(biāo)儀檢測 ROB細(xì)胞內(nèi) ALP活性：分組刺激,將細(xì)胞懸浮于含 10%去類固醇 FBS的高糖DMEM中,調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×104/mL,加入 96孔板,培養(yǎng)于 37℃、5%CO2和飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi) 72 h。按試劑盒操作步驟處理 96孔板中的細(xì)胞,在 405 nm波長下測定各孔的吸光度。按如下公式計算樣品中堿性磷酸酶(ALP)活性：

ALP活性(金氏單位/100 mL)=(測定管吸光度 /標(biāo)準(zhǔn)管吸光度)×0.005×(100/0.05)

1.2.5 Western Blot檢測 p38MAPK磷酸化激活狀態(tài)的變化：探討 p38MAPK在 ESW和間歇 rhPTH 1-34促進體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞(ROB)成骨的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析。數(shù)據(jù)均以 mean+SD表示,根據(jù)方差齊性與否,組間差異采用 ANOVA方差分析或校正方差分析,組間比較采用 LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH 1-34刺激可顯著增加 A490值(P＜0.01),這種促進作用不能被p38MAPK抑制劑 SB203580所明顯抑制,提示 10-11mol/L間歇 rhPTH 1-34刺激并不通過激活p38MAPK促進 ROB增殖;0.18 mJ/mm2ESW沖擊120次可顯著增加 A490值(P＜0.01),而這種促進作用能被SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進 ROB增殖;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加 A490值(P＜0.01),而這種促進作用能被抑制劑 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK起作用,詳見表 1。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)進行 DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(shù)(PI指數(shù))

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激可顯著增加 FCM檢測到 ROB的 PI值(P＜0.01),這種促進作用不能被 p38MAPK抑制劑 SB203580所明顯抑制,提示 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激并不通過激活 p38MAPK促進 ROB增殖;0.18 mJ/mm2ESW沖擊 120次可顯著增加 ROB的 PI值(P＜0.01),而這種促進作用能被 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進ROB增殖;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加 PI值(P＜0.01),而這種促進作用能被抑制劑 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活p38MAPK起作用,見表 1。

2.3 酶標(biāo)儀檢測 ROB細(xì)胞內(nèi) ALP活性

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激可顯著增加 ROB的細(xì)胞內(nèi) ALP活性(P＜0.01),這種促進作用不能被 p38MAPK抑制劑 SB203580所明顯抑制,提示 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激并不通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨;0.18 mJ/mm2ESW沖擊 120次可顯著增加 ALP活性(P＜0.01),而這種促進作用能被 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加 ALP活性(P＜0.01),而這種促進作用能被抑制劑 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活p38MAPK起作用,見表 1。

2.4 Western Blot檢測 p38MAPK磷酸化激活狀態(tài)

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激并不能促進磷酸化激活的 p-p38MAPK表達;0.18 mJ/mm2ESW沖擊 120次可顯著增加 p-p38MAPK表達(P＜0.01),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加p-p38MAPK表達(P＜0.01)。見圖 1～3。

表 1 SB203580對 ESW刺激和間歇性rhPTH 1-34(10-11mol/L)刺激對ROB成骨分化的影響Tab 1 Effectof SB 203580 to ESW and rhPTH 1-34 stimulations'affection to ROB

圖1 內(nèi)參 β-tubulin(54 kD)Fig 1 Exp ression ofβ-tubu lin(54 kD)

圖2 磷酸化p38MAPK(38 kD)Fig 2 Expression of p 38MAPK(38 kD)

圖3 用 Western Blot檢測 p-p 38MAPK表達Fig 3 P-p38MAPK expression detected by WB＊與對照和加入SB 203580組比較,P＜0.01

3 討 論

PTH是參與調(diào)節(jié)體內(nèi)成骨的重要因素。常人PTH分泌呈日節(jié)律波動,6AM最高,4PM最低,PTH濃度于 1～5×10-12mol/L之間波動。人體內(nèi) PTH的分泌遵循兩種時相原則：①PTH分泌量在頻繁活動中,這種濃度特點可以調(diào)節(jié)血鈣平衡;②PTH分泌狀態(tài)高度穩(wěn)定,每天的分泌次數(shù)、分泌量都有一定規(guī)律,這一濃度特點有助于維持正常骨量及骨代謝。此兩種時相被某種生理“開關(guān)”控制,在需要時會相互轉(zhuǎn)換,因而不同的 PTH使用方案會有截然不同的影響體內(nèi)成骨的效果[6]。體內(nèi)骨質(zhì)的溶解和重塑是處在一個動態(tài)平衡之中,這種動態(tài)平衡又依賴于成骨細(xì)胞(OB)和破骨細(xì)胞(OC)功能之間的平衡。PTH對 OB和 OC功能的平衡調(diào)節(jié)是非常精細(xì)和微妙的,在某一低濃度范圍內(nèi),OB和 OC分化和功能處于平衡狀態(tài),所以骨代謝保持平衡;如果 PTH濃度持續(xù)升高,OC的重吸收作用繼續(xù)增加,而 OB的成骨作用卻相對減弱或消失,結(jié)果會導(dǎo)致骨質(zhì)吸收增加[7-9]。研究表明,高濃度持續(xù) PTH刺激可引起骨質(zhì)疏松,這種情況可見于甲旁亢所引起的骨質(zhì)疏松[10];而低劑量間歇 rhPTH1-34刺激卻被證明可促進成骨。本實驗用已經(jīng)證明可促進 ROB增殖成骨[11]的 10-11mol/L間歇低劑量 rhPTH1-34刺激作用于 ROB,用 p38MAPK抑制劑 SB203580來試圖抑制其促進 ROB成骨的作用,發(fā)現(xiàn) SB203580并不能抑制 10-11mol/L間歇低劑量rhPTH 1-34刺激促進ROB增殖成骨的作用,說明低劑量間歇 rhPTH1-34刺激并非通過激活 p38MAPK促進ROB成骨。

適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激可以促進體內(nèi)、外成骨,因而近來在骨組織工程構(gòu)建方式上提出應(yīng)力化、持續(xù)灌流構(gòu)建的概念[12-14]。多個關(guān)于 ESW的研究證實,ESW可以使作用部位的流體力學(xué)狀態(tài)改變并對處于作用范圍中的細(xì)胞產(chǎn)生流體剪切應(yīng)力(FSS)和牽拉作用[15,16];成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞一直被認(rèn)為是主要的應(yīng)力感受細(xì)胞,實驗表明適當(dāng)?shù)?.18mJ/mm2ESW刺激可顯著促進ROB增殖和成骨分化。本實驗采用已經(jīng)證明可明顯促進 ROB成骨的 ESW刺激[11]作用于ROB,并借助p38MAPK抑制劑 SB203580來觀察 ESW是否通過 p38MAPK起作用;發(fā)現(xiàn),SB203580可明顯抑制 ESW促進 ROB增殖成骨的作用,更進一步Western Blot檢測證實了 ESW可促進 ROB中磷酸化激活的 p38MAPK的表達,說明 ESW刺激確實通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨。

在人體環(huán)境中,成骨細(xì)胞處于生理劑量 PTH作用和持續(xù)不斷的應(yīng)力刺激之下,這兩種因素共同作用對 ROB增殖、分化的影響和機制尚不清楚。本研究采用間歇 rhPTH1-34(1×10-11mol/L,每 24 h的前 8 h刺激,連續(xù)刺激 2個 24 h)與 0.18 mJ/mm2ESW(120次)刺激共同作用于體外培養(yǎng)的 ROB(為盡量排除血液中其他活性成分的干擾,實驗過程中采用去類固醇血清),結(jié)果發(fā)現(xiàn),rhPTH 1-34間歇刺激 +0.18 m J/mm2ESW(120次)刺激作用最強,能明顯促進 ROB體外增殖和成骨分化,作用顯著強于 0.18 mJ/mm2ESW(120次)組和 rhPTH1-34(1×10-11mol/L間歇刺激);這也有助于解釋為什么體育鍛煉和低劑量間歇 PTH注射可以促進骨質(zhì)形成。這種促進作用也可被 p38MAPK抑制劑SB203580所明顯抑制,這也印證了 p38MAPK參與ESW+PTH促進 ROB成骨的作用過程,與前面的結(jié)論相印證。

在體內(nèi)環(huán)境中(PTH和應(yīng)力刺激并存),骨吸收和骨形成保持平衡。如果出現(xiàn)抑制骨形成、促進骨吸收的因素,如甲旁亢造成持續(xù)超生理劑量 PTH刺激或者缺乏運動等因素,這一平衡會向骨質(zhì)吸收傾斜,出現(xiàn)骨質(zhì)疏松等表現(xiàn);如果出現(xiàn)促進骨形成、抑制骨吸收的因素,如低劑量間歇 PTH刺激和適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激等,這一平衡會向骨質(zhì)形成傾斜。雖然,低劑量間歇 PTH刺激和適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激被觀察到可促進體外培養(yǎng)的 ROB增殖、成骨分化,并且p38MAPK參與 ESW作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),但這些作用的詳細(xì)分子機制遠(yuǎn)未明了,尚需進一步研究。

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Role of p38MAPK in signal transduction of low density ESW and low dose interm ittent rhPTH1-34′saction on bone form ation of cultured rat osteoblasts

WANG Li1,LIU Chang-jian2,LUO Zong-jian3
(1.DepartmentofMedical Radiology,the Friendship Hospitalof Dalian,Dalian 116001China;2.Orthopedic department,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011 China;3.Orthopedic department,Affiliated Hospital of Changchun Chinese Medicine University,Changchun 130021 China)

[Objective]To investigate the role of p38MAPK in the signal path way of low density ESW and low dose intermittent rhPTH 1-34 stimu lation′s action on rat osteoblasts.[Methods]After stimulations of 0.18 mJ/mm2ESW and 10-11mol/L intermittent rhPTH 1-34,the specific inhibitor of p38MAPK was added for finding the roleof p 38MAPK in the intracellular signal path way.The rat osteoblasts were collected,and cu ltured was detected,p roliferation of these cells was observed by MTT and bone formation bymeasuring ALP activity.The exp ression of p-p38MAPK was detected by Western blot.[Results]Enhaning effect on bone formation by ESW can be significantly inhibited by SB203580,a inhibitor of p38MAPK(P＜0.05).But the enhancement of ROBs'bone formation by intermittent rhPTH 1-34 can not be inhibited by SB203580.Suitable ESW stimulation can improve the expression ofp38MAPK,but intermittent rhPTH 1-34 stimulation can not.[Conclusions]Suitable ESW stimulation can enhance bone formation of ROB by activation of p 38MAPK.The enhancement of ROBs'bone formation by intermittent rhPTH 1-34 stimulation dosen't depend on activation of p38MAPK.

osteoblast;extracorporeal shock wave(ESW);rhPTH 1-34;p38MAPK

R 336

A

1671-7295(2011)01-0031-05

2010-11-25;

2010-12-08

王 李(1975-),女,遼寧大連人,主治醫(yī)師,碩士。 E-mail：childliu@sohu.com

劉長劍,主治醫(yī)師,博士。E-mail：child.liu@yahoo.com.cn