復合酶水酶法提取大豆蛋白的工藝優(yōu)化

李 楊，江連洲,*，隋曉楠，王 辰，王中江，劉 雯

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學 國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

復合酶水酶法提取大豆蛋白的工藝優(yōu)化

李 楊1,2，江連洲1,2,*，隋曉楠1，王 辰1，王中江1，劉 雯1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學 國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

采用復合酶水酶法提取大豆蛋白。水解酶選用堿性蛋白酶，復合酶采用纖維酶、半纖維酶、果膠酶。得出最優(yōu)復合酶水酶法提取大豆蛋白工藝條件為料水比1∶6(g/mL)、纖維素酶添加量0.64%、半纖維素酶添加量0.56%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后，再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶，加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解pH9.26、水解3.6h。經(jīng)過驗證實驗可知，在最優(yōu)酶解工藝條件下總蛋白提取率可達到極大值即85.78%。經(jīng)過復合酶酶解預處理比傳統(tǒng)的濕熱預處理的總蛋白提取率提高了近10%，其原因經(jīng)分析是經(jīng)過復合酶酶解處理的豆粉其細胞結構充分破壞，使得酶的作用位點暴露更有利于蛋白酶的作用，具體的機理分析有待進一步研究。

水酶法；復合酶；大豆蛋白；混料設計

大豆蛋白作為加工食品的原料，由于近年來大豆蛋白對人體健康的效果得到科學的證實后，多數(shù)食品企業(yè)開始以大豆蛋白開發(fā)和生產(chǎn)新食品[1]。全球植物油料每年的產(chǎn)量巨大，特別是花生、大豆和菜籽等油料作物，但由于提取油脂后蛋白變性嚴重，難以開發(fā)為食用蛋白，是巨大的資源浪費。水酶法提油條件溫和，油料蛋白的性能幾乎不發(fā)生變化，無論是水相中直接加工利用，還是回收分離蛋白再利用，效果都十分理想[2]，因此成為國內(nèi)外從事相關方向?qū)W者的研究熱點。

王璋等[3]率先開展水酶法提取油脂的研究，并率先報道了水酶法從大豆中提取油和蛋白的工藝，在水酶法提油過程中將蛋白酶應用于破乳和同時制備等電點可溶蛋白。1956年，Sugarman首創(chuàng)了以水作溶劑沿用濃縮蛋白的生產(chǎn)工藝從花生中同時分離油和蛋白質(zhì)。此后的五十年左右，水提油工藝逐步在芝麻、菜籽等高含油量油料中得以應用[4]。自1972年Rhee等[5-8]在Sugarman工作基礎上，沿用分離蛋白的生產(chǎn)工藝，成功地將花生中油和蛋白質(zhì)分離。1983年美國Fullbook[9]用酶從西瓜籽中制取營養(yǎng)性的可溶性水解蛋白時，發(fā)現(xiàn)隨著水解的進行，部分油被釋放出來。隨后諸多專家用酶從菜籽與大豆中提取油與蛋白質(zhì)，取得了預期的效果[9-17]。本實驗采用復合酶水解提取大豆蛋白，以蛋白提取率為目標值對復合酶水解水酶法工藝進行研究，最終確定最適水酶法提取水解蛋白的工藝流程，為今后的中試及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(墾農(nóng)42) 黑龍江農(nóng)業(yè)科學院；Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶(1.2×105U/mL) 德國Novo公司；纖維素酶(1.5×104U/g)、半纖維素酶(5×104U/g)、果膠酶(1.5×103U/g) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

F2102型植物試樣粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；LDZ5-2型臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠；KDN-04Ⅲ型蛋白質(zhì)測定儀 上海纖檢儀器有限公司；精密電動攪拌機 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；PHS-3C酸度計 上海鵬順科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆成分測定

水分測定：參照GB 304 — 1987《水分測定》方法進行；粗脂肪的測定：參照GB 5512 — 1985《糧食、油料檢驗：粗脂肪測定法》方法進行；粗蛋白的測定：參照GB 6432 — 1994《飼料粗蛋白測定方法》方法進行；灰分測定：參照GB 5009.4 — 1985《食品中灰分的測定方法》進行。

1.3.2 工藝流程

1.3.3 計算公式總蛋白質(zhì)提取率/%=

1.3.4 復合酶工藝參數(shù)的混料設計優(yōu)化試驗

以纖維素酶添加量、半纖維素酶添加量、果膠酶添加量、復合酶水解時間分別代表的因素為自變量，以總蛋白提取率為因變量，其因素水平編碼見表1。

表1 工藝優(yōu)化試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and their coded levels in mixed design

2 結果與分析

2.1 原料基本成分

原料大豆基本成分見表2。

表2 原料大豆基本成分Table 2 Major components in soybean

2.2 混料工藝優(yōu)化試驗

混料設計試驗方案及結果見表3。

表3 復合酶水解工藝優(yōu)化試驗設計及結果Table 3 Experimental design and corresponding results

表4 回歸與方差分析結果Table 4 Variance analysis for the fitted regression equation

圖1 混料設計因素交互項對總蛋白提取率的等高線分析Fig.1 Contour plots for the pairwise effect of four hydrolysis conditions on total protein extraction efficiency

圖2 復合酶配比對總蛋白提取率的混料設計優(yōu)化結果Fig.2 Effects of cellulase, hemicellulase and pectin amounts on total protein extraction efficiency

通過統(tǒng)計分析軟件Design Expert進行數(shù)據(jù)分析，建立回歸模型如下：

回歸與方差分析結果見表4，交互作用的等高線分析圖見圖1，混料設計優(yōu)化結果見圖2。由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.001)，失擬項不顯著，并且該模型R2=92.18%，R2Adj=82.02%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到因素貢獻率為AB＞BC＞AC，即纖維素酶與半纖維素酶混合作用水解＞半纖維素酶與果膠酶混合作用水解＞纖維素酶與果膠酶混合作用水解。

由圖1分析結果可看出：A(纖維素酶添加量)、B(半纖維素酶添加量)、C(果膠酶添加量)、D(復合酶水解時間)的交互作用對總蛋白提取率的影響。由圖1a、1b可以看出當纖維素酶和半纖維素酶添加按照1∶1配比添加附近有較大值出現(xiàn)，說明在試驗中添加果膠酶對總蛋白提取率影響不大。由圖1b、1c和1d可以看出，當酶解時間過長總蛋白提取率反而下降，分析原因是水解pH值在酸性條件下，水解時間延長導致蛋白質(zhì)變性不利于后期蛋白酶水解蛋白質(zhì)，并且可以看出最佳酶解時間出現(xiàn)在0.3～0.75附近。

由圖2可知，纖維酶素與果膠酶共同水解作用對總蛋白提取率的提高較明顯，但未達到極值。半纖維素酶與果膠酶的共同水解作用對總蛋白提取率的提高不明顯。通過混料設計結果優(yōu)化可知，當復合酶酶解時間大于0.33水平即45min時，無需添加果膠酶，纖維素酶添加量與半纖維素酶添加量水平值配比為31.8∶37.1時，總蛋白提取率有較大值在86.4%左右。其最優(yōu)復合酶水解工藝為纖維素酶添加量0.64%、半纖維素酶添加量0.56%、兩種酶在pH5條件下復合水解45min后，再利用堿性蛋白酶在最優(yōu)條件下水解3.6h，可使總蛋白提取率達到86.4%左右。

2.4 驗證實驗

通過對復合酶(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶)不同配比水解工藝參數(shù)對各考察指標影響的混料試驗，得到了總蛋白提取率的優(yōu)化值。在兩個考察指標最優(yōu)的復合酶水解工藝條件下，進行5次驗證實驗取平均值，在最優(yōu)復合酶水解條件下各考察指標的驗證值與預測值之間的標準偏差均在合理范圍內(nèi)，說明響應值的驗證實驗值與回歸方程預測值吻合良好。兩個考察指標均可在混料設計優(yōu)化的復合酶配比水解工藝條件下，得到較大的提取率。由此結果可以看出，在纖維素酶添加量為0.64%和半纖維素酶添加量為0.56%時，總蛋白提取率分別達到極大值即85.78%。

3 結 論

本實驗研究復合酶配比對水酶法提取大豆蛋白得率的影響規(guī)律，并且利用混料優(yōu)化設計對最適合水酶法提取大豆蛋白的復合酶配比和水解條件進行優(yōu)化，建立相應的數(shù)學模型，為中試以及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎，所得結果如下：確定最優(yōu)復合酶水解水酶法提取大豆油脂和蛋白工藝條件為料水比1∶6(g/mL)、纖維素酶添加量0.64%、半纖維素酶添加量0.56%、酶解pH5、酶解溫度37℃條件下水解0.75h后，再利用Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶，加酶量1.85%、酶解溫度50℃、酶解pH9.26、水解3.6h，總蛋白提取率分別達到極大值即85.78%。經(jīng)過復合酶酶解預處理比傳統(tǒng)的濕熱預處理的總蛋白提取率提高了近10個百分點，其原因經(jīng)分析是經(jīng)過復合酶酶解處理的豆粉其細胞結構充分破壞，使得酶的作用位點暴露更有利于蛋白酶的作用，具體機理分析有待于進一步研究。

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Optimization of Multi-enzyme Hydrolysis for Soybean Protein Extraction

LI Yang1,2，JIANG Lian-zhou1,2,*，SUI Xiao-nan1，WANG Chen1，WANG Zhong-jiang1，LIU Wen1
(1. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. National Institute of Soybean Engineering Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

A two-step enzymatic method was presented for soybean protein extraction by sequential hydrolysis with multiple enzymes (simultaneously added) and alcalase. The multiple-enzyme hydrolysis process was optimized by using mixed design to modeling the effects of cellulase amount, hemicellulase amount, pectin amount and hydrolysis time on total protein extraction efficiency. The optimal hydrolysis conditions for soybean protein extraction were hydrolysis at pH 5, 37 ℃ and a material/ liquid ratio of 1∶6 (g/mL) for 0.75 h with 0.64% cellulase and 0.56% hemicellulase and for another 3.6 h at 50 ℃ and pH 9.26 with 1.85% alcalase. Under these conditions, a maximum total protein extraction efficiency of 85.78% was observed. Multipleenzyme hydrolysis caused an increase in total protein extraction efficiency by nearly 10% when compared with traditional heatmoisture treatment. We speculated that the reason for this was due to complete disruption of the soybean cellular structure after multiple-enzyme hydrolysis. However, the detailed mechanisms remain to be clarified.

aqueous enzymatic method；multiple-enzyme hydrolysis；soybean protein; mixed design

Q816；TQ464.7

A

1002-6630(2011)14-0130-04

2010-09-23

黑龍江省攻關項目(GA09B401-6)

李楊(1981—)，男，講師，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：liyanghuangyu@163.com

*通信作者：江連洲(1960—)，男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com