蔣 斌 魏 駿

(巢湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 安徽巢湖 238000;①巢湖市壩鎮(zhèn)衛(wèi)生院)

血吸蟲(chóng)病(schistosomiasis)是呈世界性分布的嚴(yán)重危害人類(lèi)及家畜的寄生蟲(chóng)病，發(fā)病率僅次于瘧疾(malaria)。全世界至少有2億血吸蟲(chóng)病感染者。該疾病流行區(qū)仍有6億人受其威脅[1]，我國(guó)是受日本血吸蟲(chóng)病危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，流行株為日本血吸蟲(chóng)中國(guó)大陸株(Chinese Mainland Strain)，全國(guó)血吸蟲(chóng)病流行縣(市、區(qū))454個(gè);累計(jì)達(dá)到血吸蟲(chóng)病傳播消滅標(biāo)準(zhǔn)的縣(市、區(qū))265個(gè)，2009年度，我國(guó)實(shí)有患者36.6萬(wàn)人[2]。本文概述了防治日本血吸蟲(chóng)病的核酸疫苗的免疫機(jī)制、特點(diǎn)及我國(guó)日本血吸蟲(chóng)核酸疫苗候選分子的研究進(jìn)展。

1 核酸疫苗的免疫機(jī)制及特點(diǎn)

1990年Wolff等[2]人將DNA重組表達(dá)載體注入小鼠的骨骼肌中，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)載體上的基因在局部肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，且產(chǎn)生了抗體，這一偶然發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致核酸疫苗的誕生。由于大多利用質(zhì)粒DNA載體進(jìn)行核酸疫苗研究，因而核酸疫苗又稱(chēng)為DNA疫苗。

1.1 核酸疫苗的免疫機(jī)制 免疫機(jī)制主要有以下3點(diǎn):①核酸疫苗接種后，被結(jié)合在游離核糖體上的mRNA翻譯而表達(dá)合成的內(nèi)源性抗原蛋白，其中一部分以有效的比例結(jié)合到泛肽上，呈遞給蛋白酶，降解為多肽，通過(guò)抗原肽轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)(TAP)運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，與MHC－Ⅰ類(lèi)分子形成聚合體，抗原多肽－MHC－Ⅰ類(lèi)分子聚合體通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基體，最終到達(dá)細(xì)胞膜的表面，誘發(fā)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生。②另一部分蛋白抗原從分泌它們的抗原遞呈細(xì)胞(APC)的細(xì)胞膜上進(jìn)入MHC－Ⅱ類(lèi)型途徑，進(jìn)入MHC－Ⅱ類(lèi)呈遞途徑的蛋白在溶酶體中水解，產(chǎn)生大約20～25個(gè)氨基酸的多肽，這些溶酶體和包含MHC－Ⅱ分子的囊泡融合，MHC－Ⅱ分子結(jié)合合適的多肽形成MHC異聚體，成熟的MHC異聚體在細(xì)胞膜表面刺激CD4+T細(xì)胞，引發(fā)體液免疫應(yīng)答。③一部分抗原多肽遞呈給B細(xì)胞，使B細(xì)胞自身活化，產(chǎn)生特異性抗體，誘發(fā)體液免疫。另外，遞呈后的CD4+輔助性T細(xì)胞(Th)活化、增殖可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)和強(qiáng)化體液免疫和細(xì)胞免疫。胞內(nèi)型的蛋白分子在與MHC－Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合后，是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的最好抗原形式。

1.2 核酸疫苗的特點(diǎn) 與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗有以下優(yōu)點(diǎn):①可以模擬減毒活疫苗產(chǎn)生全身性保護(hù)性免疫反應(yīng)，而不需使用復(fù)制型載體或活的微生物就可產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，在宿主細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)經(jīng)歷了加工、修飾，然后遞呈給宿主免疫系統(tǒng)等與自然感染相似的過(guò)程，更接近天然分子形式包含構(gòu)型相關(guān)位點(diǎn)，因而能誘導(dǎo)更有效的免疫應(yīng)答。②生產(chǎn)簡(jiǎn)便、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯存方便。質(zhì)粒DNA可以制成干粉樣制劑型，在常溫下穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。③可誘導(dǎo)出全方位免疫，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。核酸疫苗免疫后，可檢測(cè)出較高滴度的特異性抗體和CTL反應(yīng)。④使用安全，沒(méi)有感染病原體的危險(xiǎn)，利用質(zhì)粒作載體，不涉及感染性因子。⑤同種異株的交叉保護(hù)作用。采用同種不同株之間的保守DNA序列作核酸疫苗，可以使其免疫作用突破地理株的限制，同種異株間有交叉免疫保護(hù)作用。⑥將不同病原體的DNA序列克隆到同一質(zhì)粒載體輸入機(jī)體聯(lián)合免疫，可產(chǎn)生對(duì)兩種病原體的共同保護(hù)作用。⑦不僅有良好的預(yù)防作用，而且對(duì)現(xiàn)癥患者有一定的治療作用。

2 我國(guó)候選血吸蟲(chóng)核酸疫苗的研究

2.1 副肌球蛋白(Sj97)97kDa的副肌球蛋白是大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物(包括血吸蟲(chóng))肌肉組織內(nèi)的一種結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為97kDa。Yang等首先報(bào)道了用編碼日本血吸蟲(chóng)97kDa分子的基因片段cDNA與真核細(xì)胞表達(dá)載體pRSV－BL構(gòu)建裸露DNA，即PMY6，然后直接注射小鼠股四頭肌，產(chǎn)生了識(shí)別日本血吸蟲(chóng)97kDa蛋白的抗體。陳家旭等[3]報(bào)道將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成疫苗組、空質(zhì)粒組、感染對(duì)照組和空白對(duì)照組攻擊感染后7周，剖殺小鼠檢測(cè)肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫直徑Sj97DNA疫苗組(183.75±42.36)μm，顯著小于空質(zhì)粒組的(303.12 ±37.36)μm 和感染對(duì)照組的(304.38±53.23)μm，表明Sj97DNA具有一定的抗蟲(chóng)卵肉芽腫及抗肝纖維化作用。

2.2 谷光甘肽－S－轉(zhuǎn)移酶(GST)GST是以谷胱甘肽為共同底物的一組具有解毒功能的同工酶，被公認(rèn)為具有很大潛在價(jià)值的疫苗分子。日本血吸蟲(chóng)至少有兩種26kDa和28kDa的同工酶(Sj26、Sj28)。血吸蟲(chóng)的GST含量豐富，有助于其在宿主體內(nèi)寄生。Shi Fuhui等以Sj28 GST肌注免疫綿羊，先以200條尾蚴攻擊感染，得到65.0%的減蟲(chóng)率和70.5%肝組織減卵率。但第二次實(shí)驗(yàn)以300條尾蚴攻擊感染，獲得30.4%減蟲(chóng)率和43.1%肝組織減卵率，效果不顯著。Sj28GST核酸疫苗對(duì)黃牛進(jìn)行田間免疫試驗(yàn)，取得明顯的免疫保護(hù)效果，減蟲(chóng)率43.6%，糞便減卵率76.9%。提示用此疫苗對(duì)黃牛進(jìn)行大規(guī)模免疫預(yù)防，可減少人群感染的機(jī)會(huì)。楊平等[4]用構(gòu)建的pIRES－Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)血清總IgG抗體濃度、INF－γ的含量明顯高于空白對(duì)照組和空載體組;其脾臟大小指數(shù)(脾SI)高于空白對(duì)照組和空載體組;CD8+細(xì)胞百分比高于空白對(duì)照組和空載體組，表明pIRES－Sj26疫苗能增強(qiáng)BALB/c小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

2.3 23 kDa膜蛋白(Sj23)Sj23的結(jié)構(gòu)區(qū)與一組哺乳動(dòng)物膜蛋白(如淋巴細(xì)胞表達(dá)蛋白CD37、CD53和TAPA－1等)的表面標(biāo)志CD53同源，這組膜蛋白的主要功能與細(xì)胞增殖有關(guān)。因此Sj23在細(xì)胞增殖和血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)中起著重要作用。李柳哲等將日本血吸蟲(chóng)真核表達(dá)載體pBK－Sj23，pBK－Sj26以及pCDSj23，pCD－Sj26，分別接種小鼠股四頭肌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗pCDSj23和pCD－Sj26誘導(dǎo)小鼠的減蟲(chóng)率和減卵率分別為30.5%和33.0%，疫苗pBK－Sj23和pBK－Sj26誘導(dǎo)小鼠的減蟲(chóng)率和減卵率分別為18.2%和21.7%，含血吸蟲(chóng)同一抗原分子的不同載體誘導(dǎo)小鼠的抗攻擊感染能力具有顯著性差異。柳建發(fā)等[5]用編碼Sj23－pcDNA質(zhì)粒免疫的小鼠產(chǎn)生了針對(duì)Sj23的特異性IgG，而pcDNA對(duì)照組免疫小鼠血清則無(wú)此作用，也證明Sj23－pcDNA疫苗對(duì)日本血吸蟲(chóng)攻擊感染有一定的保護(hù)力。

2.4 天冬酰胺肽鏈內(nèi)切酶(Sj32) 國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)Sj32核酸疫苗進(jìn)行了深入的研究，并取得了一些可喜成績(jī)。謝來(lái)平等分別以100μg/100μL的pCD－Sj32經(jīng)股四頭肌注射免疫 BALB/c小鼠，結(jié)果各免疫組與對(duì)照組相比均產(chǎn)生較好的保護(hù)免疫效果，減成蟲(chóng)率為35.6%～44.44%，肝組織減卵率為39.6%～69.1%。Wei F等[6]將pVAX/Sj26GST和pVAX/Sj26GST+ILl8共同免疫小鼠，減蟲(chóng)率分別為30.1%和49.4%，相應(yīng)的肝臟和糞便的減卵率分別為44.8%、53.0%和50.6%、56.6%。

2.5 磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)TPI為二聚體糖酵解酶，它是一種優(yōu)勢(shì)蛋白，分布于各種生物的所有組織中，也是一種重要的抗血吸蟲(chóng)病疫苗候選分子。魯飛等[7]利用磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(TPI基因)密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗分A(pcDNA3.1空質(zhì)粒對(duì)照組)、B(pcDNA3.1－TPI組)、C(pcDNA3.1 －TPI－mHSP70組)、D(pcDNA3.1－TPLopt組)、E(pcDNA3.1－TPLopt－ mHSP70組)等5組免疫BALB/C小鼠，B、C、D、E組小鼠血清均檢測(cè)到特異性IgG及IgG2a與IgG1抗體，IgG2a/IgG1的比值分別為1.73、2.06、2.44、3.09。D、E 組的 IL －2、IFN－γ、TNF 含量較B、C組均有不同程度地升高。D、E組減蟲(chóng)率分別為36.03%、39.03%，減卵率分別為41.71%、46.85%，均顯著高于 B、C 組(P＜0.01)，表明TPI基因密碼子優(yōu)化后的DNA疫苗相對(duì)于未優(yōu)化TPI DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)作用，且誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的以Th1為主的免疫應(yīng)答。

2.6 脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP) 脂肪酸結(jié)合蛋白是血吸蟲(chóng)脂代謝過(guò)程中的必需載體，對(duì)血吸蟲(chóng)在脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)的發(fā)育起決定作用。FABP分子既可作為疫苗候選分子又可作為藥物靶。其全基因序列為578bp(mRNA)，內(nèi)含一個(gè)399bp的編碼區(qū)。余傳信等構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒SjFABP－pcDNA3.1，通過(guò)肌肉注射免疫BALB/c小鼠，顯示該核酸疫苗有一定的抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)性作用。朱曉華等[8]成功構(gòu)建和表達(dá)重組質(zhì)粒pVIV02－Sj14FABP，免疫BALB/c小鼠，分別獲得24.1%的減蟲(chóng)率和27.2%的減卵率，表明該核酸疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生部分抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)力。

2.7 粘蛋白樣蛋白(MLP) 血吸蟲(chóng)的MLP屬于性發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白的一種，其基因是目前所知的唯一不在卵黃腺表達(dá)的血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)特異性序列。劉彥等[9]將日本血吸蟲(chóng) pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗對(duì)家兔免疫作用，結(jié)果可明顯抑制家兔肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的大小，肉芽腫數(shù)量減少，肝組織減卵率為28.1%，并可誘導(dǎo)IgA、IgG1變化，誘生INF－γ應(yīng)答，表明該疫苗對(duì)日本血吸蟲(chóng)尾蚴攻擊感染可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。

2.8 日本血吸蟲(chóng)信號(hào)蛋白14－3－3(Sj14－3－3) 劉慶中等[10]將Sj14－3－3DNA免疫BALB/c小鼠進(jìn)行攻擊感染實(shí)驗(yàn)，6周后，剖殺小鼠減蟲(chóng)率與減卵率分別為34.2%和50.7%，表明重組Sj14－3－3DNA具有一定的抗血吸蟲(chóng)病潛能，有可能作為日本血吸蟲(chóng)病的候選疫苗。李德發(fā)等將765bp的Sj14－3－3編碼基因插入pBK－CMV，構(gòu)建pBK－Sj14－3－3。將100g重組質(zhì)粒肌肉注射免疫BALB/c鼠，3周后加強(qiáng)1次，末次免疫后5天用40條Sj尾蚴進(jìn)行攻擊，攻擊后6周發(fā)現(xiàn)免疫鼠的減蟲(chóng)率和肝組織的減卵率分別為27%和79%，鼠肝肉芽腫直徑減少29%，表明pBK－Sjl4－3－3也可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)力。

2.9 SjCWL01 該基因全長(zhǎng)636bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)分析含有一個(gè)462bp大小的完整閱讀框，其起始密碼子為ATG，位于第68～70個(gè)核苷酸，終止密碼子TAG，位于第527～529位核苷酸，3＇端有較長(zhǎng)的PolyA尾?；蚓幋a153個(gè)氨基酸，理論分子量為17.5kDa。彭先楚等[11]構(gòu)建了日本血吸蟲(chóng) pcDNA3/SjCWL01 核酸疫苗免疫小鼠結(jié)果顯示，重組DNA疫苗與對(duì)照組比較，蟲(chóng)荷、每克肝卵、每克糞卵數(shù)分別下降了27.6%、39.5%、45.9%，表明該疫苗具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生部分抗血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)力。

2.10 混合或多價(jià)疫苗 血吸蟲(chóng)病各種核酸疫苗作為單一成分在動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)中都不同程度地取得了成功，而血吸蟲(chóng)是一種多細(xì)胞生物，生活史復(fù)雜，在長(zhǎng)期與宿主共進(jìn)化的過(guò)程中產(chǎn)生了多種免疫逃避機(jī)制。目前混和(或)多價(jià)核酸疫苗被廣泛研究。

李春艷等[12]成功構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)多價(jià)DNA疫苗pVIVO2－SjFABP－23，免疫小鼠進(jìn)行免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，獲得52.1%減蟲(chóng)率和60.9%的減卵率，且均高于單價(jià)疫苗pVIVO2－Sj23。夏濤等[13]用二價(jià)DNA疫苗pVIVO2－SjFABP－SjGST在體內(nèi)誘發(fā)的特異性抗體分別與pET30a－SjFABP及pET30a－SjGST原核表達(dá)的抗原蛋白產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。徐元宏等[14]在證明核酸疫苗pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3具有部分抗血吸蟲(chóng)感染的基礎(chǔ)上，聯(lián)合使用CpG和pcDNA3.1(+)－mIL－12免疫小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3+pcDNA3.1(+)－mIL－12和pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3+CpG免疫小鼠的減蟲(chóng)率分別為41.2%和28.7%;減卵率分別為52.6%和41.2%。說(shuō)明核酸疫苗pcDNA3.1(+)－Sj14－3－3抗血吸蟲(chóng)攻擊感染作用在mIL－12和CpG等佐劑作用下得到增強(qiáng)。余光清等[15]將654bp的Sj26GST的cDNA片段克隆入pEGFP－N3，構(gòu)建pEGFP－Sj26GST;將100μg的pEGFP－Sj26GST肌肉注射免疫BALB/c鼠，2周后加強(qiáng)1次，4周后用50μg的rSj26GST抗原皮下注射加強(qiáng)1次，末次免疫后2周后用40條Sj尾蚴進(jìn)行攻擊，在攻擊6周后免疫鼠的減蟲(chóng)率和肝組織減卵率分別為50.8%和32.7%，說(shuō)明pEGFP－Sj26GST質(zhì)?？烧T導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的保護(hù)力。魏峰等[16]分別以肌肉注射重組質(zhì)粒pVAX－GST、pIRESneo－Sj23、pVAX－GST－FABP和pIRESneo－GST－FABP－Sj23均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的IgG抗體，pIRESneo－GST－FABPSj23免疫組所誘導(dǎo)的IgG水平最高，減蟲(chóng)率分別為26.1%、30.8%、33.2%和47.5% ，減卵率分別為25.4% 、45.0%、48.4% 和69.8%。pIRESneo－GST－FABP－Sj23的減卵率和減蟲(chóng)率明顯高于其他DNA疫苗。魯燕妮等[17]利用從香菇中提取的多糖進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明植物多糖對(duì)日本血吸蟲(chóng)疫苗pVIVO2－Sj14－Sj23有較好的增效作用，并在此基礎(chǔ)上初步探討了植物多糖佐劑對(duì)血吸蟲(chóng)疫苗的增效機(jī)理。胡媛等[18]通過(guò)基因拼接法構(gòu)建pVIVO2－Sj14－3－3－Sj23融合質(zhì)粒。將pVIVO2－Sj14－3－3－Sj23和 pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23等量混合后，建成混合DNA疫苗。將100μg的 pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23、pVIV02－Sj14－3－3－Sj23和混合質(zhì)粒肌肉注射分別免疫BALB/c鼠，4周后用40條Sj尾蚴進(jìn)行攻擊。攻擊后6周發(fā)現(xiàn)pVIVO2－Sjl4－3－3/Sj23免疫鼠的減蟲(chóng)率和減卵率分別為41.20%和53.83%，pVIVO2－Sjl4－3－3－Sj23免疫鼠分別為53.26%和39.78%，混合質(zhì)粒免疫鼠分別為58.97%和47.68%，所有免疫鼠的肝蟲(chóng)卵肉芽腫體積顯著縮小，提示混合質(zhì)粒的免疫效果類(lèi)似于pVIVO2－Sj14－3－3/Sj23或pVIVO2－Sjl4－3－3－Sj23融合質(zhì)粒。門(mén)靜濤等[19]將小鼠IL－18基因和日本血吸蟲(chóng)Sj23膜蛋白基因分別插入pVAX1載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX/mlL－18和pVAX/Sj23，聯(lián)合或單獨(dú)免疫小鼠，以pVAX1空載體作對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果表明，聯(lián)合免疫組能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)可溶性抗原(SWAP)IgG，較高水平的IFN－γ和IL－2。攻蟲(chóng)試驗(yàn)表明，聯(lián)合免疫小鼠成蟲(chóng)減蟲(chóng)率和肝臟減卵率分別達(dá)41.6%和49.4%，明顯高于pVAX/Sj23單獨(dú)免疫組(減蟲(chóng)率和肝臟減卵率分別為26.5%和41.4%)。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，IL－18能明顯增強(qiáng)Sj23DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答，并且產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)作用。

這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一些抗原分子組成的多基因疫苗或混合佐劑誘導(dǎo)宿主的免疫力往往存在一定程度上的協(xié)同作用，從而提高宿主抗血吸蟲(chóng)感染的能力。

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