徐震 牛堅(jiān) 劉斌

（1.徐州醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇徐州221002；2.徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，江蘇徐州221006）

基因治療是一種新的治療腫瘤的方法，其難點(diǎn)是效益基因在腫瘤細(xì)胞中的靶向性及其高效表達(dá)。而survivin基因在成人正常細(xì)胞中不表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中表達(dá)其啟動(dòng)子具有良好的靶向性。胰島素樣生長(zhǎng)因子1類(lèi)受體表達(dá)與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R慢病毒，探討其對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響，為肝癌基因治療拓展新的思路。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人 IGF1R多克隆抗體：Sant Cruze公司；Lipofectamin2000：Invitrogen公司；限制性?xún)?nèi)切酶ScaI、ClaⅠ、SpeI、PmeI、XhoⅠ、EcoRⅠ、ApaI和 NheI，T4 DNA連接酶，購(gòu)于大連寶生物公司；CCK-8試劑盒：DOJINDO公司；質(zhì)粒提取試劑盒、回收試劑盒購(gòu)于上海生物工程有限公司；PCR引物和其他試劑購(gòu)于博亞公司。

1.2 主要材料

1.3 包膜質(zhì)粒pMD2G-anti-AFP-scFv質(zhì)粒的構(gòu)建

以表達(dá)anti-AFP-scFv的質(zhì)粒pMON-scFv為模板，設(shè)計(jì)兩端含SacⅠ和ClaⅠ的酶切位點(diǎn)的引物。

將anti-AFP-scFv基因片段插入包膜質(zhì)粒pMD2G的SacⅠ和ClaⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建pMD2G-anti-AFP-scFv質(zhì)粒。

1.4 穿梭質(zhì)粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的構(gòu)建

從NCBI里找到人IGF1R基因的cDNA序列全長(zhǎng)，genbank號(hào)為NM_00875。利用網(wǎng)上的設(shè)計(jì)工具（genesil等）進(jìn)行siRNA片段的篩選，將選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成，并引入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

形成穿梭質(zhì)粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。酶切電泳鑒定及測(cè)序鑒定。

1.5 survivin-CMV肝癌特異性啟動(dòng)子的克隆

以含survivin-CMV肝癌特異性啟動(dòng)子的pBluescriptII-survivin-CMV為模板，設(shè)計(jì)上游含apaI和下游含NheI的酶切位點(diǎn)的引物。

1.6 穿梭質(zhì)粒survivin-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的構(gòu)建

survivin-CMV啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以ApaI和 NheI雙酶切，連接至同樣雙酶切的pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R，替換穿梭質(zhì)粒pPRIME中的CMV啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，用ApaI和NheI雙酶切鑒定，測(cè)序，提取質(zhì)粒名為sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

1.7 病毒的包裝、鑒定和擴(kuò)增純化

1.7.1 病毒的包裝、鑒定 將質(zhì)粒（pPRIME、pMD2G、psPAX2）、（sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R、pMD2G-anti-AFP-scFv、psPAX2）分別通過(guò)Lipofectamin2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)過(guò)病毒空斑純化，包裝成完整病毒顆粒。提取重組病毒DNA，PCR分析、測(cè)序鑒定正確者，即為目的病毒PRIME、AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

1.7.2 病毒的擴(kuò)增及滴度測(cè)定 取96孔板，每孔加293T細(xì)胞1×104個(gè)，加液量200μL，孵箱培養(yǎng)24h后更換無(wú)血清培養(yǎng)液；待測(cè)病毒用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6等稀釋度。每一濃度設(shè)3復(fù)孔，每孔每一濃度取病毒溶液200μL，同時(shí)設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照；在37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)36～48h。鏡檢觀察CEP現(xiàn)象，按公式計(jì)算出病毒滴度：病毒滴度（pfu/mL）＝每孔細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)×10/加入的病毒溶液量（mL）。

煤成說(shuō)學(xué)代表者有郭則華(1981年)、陳安定等(2004年)認(rèn)為：瀝青煤是石油烴類(lèi)的衍生礦物，石油的演化是形成瀝青煤的主要機(jī)理。這種瀝青煤實(shí)際上就是碳瀝青。其成因?yàn)楣庞筒卦馐芷茐亩纬?，即油氣散失過(guò)程中，在油氣逸散通道中，由于重質(zhì)成分不斷殘存、充填，最終完全堵塞了裂縫和孔洞而形成的。

1.8 RT-PCR檢測(cè)IGF1R在mRNA水平的變化

將L-02、SMMC7721細(xì)胞低密度鋪于6孔板，一天后用MOI=10的PRIME、AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R感染細(xì)胞，未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。48h后Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用隨機(jī)引物OligdTs合成第一鏈（嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），在20μL反應(yīng)體系中加入2μg總cDNA。IGF1RmRNA檢測(cè)引物序列為：上游：5'-GGAGGCTGAATACCGCAAAGTC-3'，下游：5'-AAAGACGAAGTTGGAGGCGCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為 398bp；內(nèi)參照 β-actin，上游：5'-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'，下游：5'-CAGTGTACAGGTAAGCCCTG-3'。退火溫度均為55℃。在同一條件下，每次PCR以β-actin為內(nèi)參照，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像，表達(dá)豐度以特異基因條帶亮度與內(nèi)參照的比值表示。

1.9 Western-blot鑒定IGF1R的表達(dá)

將L-02、SMMC7721細(xì)胞鋪于6孔板，一天后用MOI=10.0的PRIME、AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R感染細(xì)胞，未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。48h后提取核蛋白，取40μg細(xì)胞裂解液與上樣緩沖液混合，煮沸10min后上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳條件：60伏，30min；160伏，1.5h。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，甲醇固定PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的封閉液40℃孵育過(guò)夜。一抗10mL（1∶1000稀釋?zhuān)┦覝胤跤?h，二抗10mL（1∶5000稀釋?zhuān)┦覝胤跤?h后，PVDF膜用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒處理并在暗室顯影。

1.10 競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)

選擇AFP陽(yáng)性率的SMMC7721細(xì)胞株為觀察對(duì)象，在細(xì)胞感染慢病毒前6h事先加入抗AFP單抗，然后加入慢病毒共同培養(yǎng)48h，觀察綠色熒光細(xì)胞數(shù)量的變化。

1.11 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)

參照DOJINDO的Cell Count Kit-8，具體操作如下，分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，以每孔4×104~5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積為200μL；24h后換不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞靜止；將MOI=10的 PRIME、 AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R感染SMMC7721細(xì)胞，感染48h后，吸盡待測(cè)孔內(nèi)培養(yǎng)上清液；在酶聯(lián)免疫分析儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD）繪制生長(zhǎng)曲線，觀察各組細(xì)胞連續(xù)7d的細(xì)胞的增殖情況。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 anti-AFP-scFv基因片段PCR及電泳結(jié)果

以表達(dá)anti-AFP-scFv的質(zhì)粒pMON-scFv為模板，設(shè)計(jì)兩端含SacⅠ和ClaⅠ的酶切位點(diǎn)的引物。ScFv基因由696bp構(gòu)成，包含312bp中的VL和339bp的VH和兩者之間有45bp的連接序列，擴(kuò)增片段696bp（圖1）。與預(yù)期結(jié)果吻合，測(cè)序正確。

圖1 VH、VL和ScFv基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳

2.2 穿梭質(zhì)粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的鑒定

將pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R行XhoⅠ、EcoRⅠ酶切鑒定（圖2），鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。片段大小為96bp左右，但因?yàn)槠翁〔灰子^察到，電泳結(jié)果示：pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R與對(duì)照組pPRIME酶切相比，未見(jiàn)1100bp左右的帶型，且后面的帶位于同一條線上，結(jié)果與預(yù)期相符。此時(shí)命名慢病毒重組載體為pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

圖2 pPRIME-m iR30-shRNA-IGF1R的雙酶切鑒定

2.3 survivin-CMV嵌合啟動(dòng)子的鑒定

以含survivin-CMV肝癌特異性啟動(dòng)子的pBluescriptII-sur vivin-CMV為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ApaI和NheI、雙酶切，連接至同樣雙酶切的pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取重組陽(yáng)性克隆，經(jīng)ApaI和NheI雙酶切鑒定（圖3），片段大小為860bp左右，結(jié)果與預(yù)期相符。測(cè)序測(cè)序結(jié)果表明合成的surn-CMV嵌合啟動(dòng)子插入正確，此時(shí)命名慢病毒重組載體為sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

圖3 survivin-CMV嵌合啟動(dòng)子的雙酶切鑒定

2.4 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的效應(yīng)

表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，細(xì)胞部分融合，多核復(fù)合體出現(xiàn)，隨著病毒增殖，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)多量病毒顆粒，并逐漸從壁上脫落，出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)。病毒滴度測(cè)定結(jié)果顯示重組慢病毒表達(dá)克隆的滴度為4.58×l09pfu/L。

2.5 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，398bp可見(jiàn)特異性IGF1R目標(biāo)條帶（圖4），AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R中IGF1R的表達(dá)較對(duì)照組明顯減低，經(jīng)灰度掃描及與內(nèi)參照比較分析，干擾組IGF1RmRNA的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的4%（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染正常胎肝細(xì)胞L-02后IGF1R的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。

圖4 RT-PCR檢測(cè)感染慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R后IGFIRmRNA的表達(dá)

2.6 Western blot檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R轉(zhuǎn)染SMMC7721細(xì)胞，48h后細(xì)胞內(nèi)的IGF1R的表達(dá)與對(duì)照組比較明顯下降，約為對(duì)照組的9%（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染正常胎肝細(xì)胞L-02后，IGF1R蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖5。

2.7 競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)

選擇AFP陽(yáng)性率的SMMC7721細(xì)胞株為觀察對(duì)象，在細(xì)胞感染慢病毒前6h事先加入抗AFP單抗，然后加入慢病毒共同培養(yǎng)48h，加單抗為（7.5±0.4）%，未加單抗為（76±1.2）%（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

2.8 AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R對(duì)SMMC7721細(xì)胞增殖的影響

從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖7）可以看出，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯慢于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖5 Western-blot檢測(cè)感染AFP-sur-CMV-PRIME-m iR30-shRNA-IGF1R后IGFIR蛋白的表達(dá)

圖6 競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

腫瘤的基因治療中，表達(dá)基因的靶向性和高效表達(dá)是關(guān)鍵。survivin的組織分布特征具有明顯的細(xì)胞選擇性[1]，在終末分化的成人組織中不表達(dá)（除胸腺、生殖腺外），而在絕大多數(shù)腫瘤組織，包括淋巴瘤、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌等呈高表達(dá)[2]。研究表明，survivin啟動(dòng)子較CMV啟動(dòng)子，可以在腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)，具有良好的靶向性，在腫瘤的基因治療中具有良好的前景[3]。Van Houdt等[4]克隆了survivin基因起始密碼子上游第-230～+30位和第-1430～+30位兩個(gè)survivin啟動(dòng)子基因片段，證實(shí)兩者在轉(zhuǎn)錄活性、殺滅腫瘤細(xì)胞效果、體內(nèi)抑瘤效果等方面沒(méi)有顯著差異。在實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的載體中，重組入的片段過(guò)長(zhǎng)會(huì)使載體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能影響預(yù)期功能的完成。而survivin全長(zhǎng)的啟動(dòng)子已達(dá)1.5kb左右，若要完成預(yù)期作用則啟動(dòng)子后面的功能基因片段長(zhǎng)度則可能受到限制，有時(shí)無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需要。Li等[5]報(bào)道survivin基因起始密碼子上游第-268～+1位片段已具備啟動(dòng)子功能。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)利用高活性的巨細(xì)胞病毒早期基因增強(qiáng)子（CMVE）[6]增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，構(gòu)成了860bp左右的sur vivin-CMV特異性啟動(dòng)子，提高survivin啟動(dòng)子的活性，并成功表達(dá)。

圖7 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

慢病毒載體具有可以長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)外源基因，容量大，感染細(xì)胞種類(lèi)多而且高效，可以感染體內(nèi)、體外分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞，滴度高，低免疫原性，安全性高[7，8]等優(yōu)點(diǎn)，成為肝癌基因治療的理想載體。

AFP是目前肝癌生物治療和診斷中用得較多的靶抗原，抗AFP的ScFv在原發(fā)性肝癌的生物治療和診斷中都具有重要的作用[9]。

IGF1R是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶，在多種腫瘤細(xì)胞中有高水平表達(dá)[10-12]。但在正常肝組織表達(dá)量極少，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）受體對(duì)細(xì)胞的有絲分裂作用及轉(zhuǎn)化潛能必須通過(guò)IGF1R才能發(fā)揮，而過(guò)表達(dá)的IGF1R則不需要EGF受體即可引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究還表明IGF1R的數(shù)量水平在細(xì)胞生存中起著決定性作用，只有達(dá)到某一水平，才能將細(xì)胞由不進(jìn)行有絲分裂的模式轉(zhuǎn)化為有絲分裂模式[13]。RNA干擾技術(shù)是重要的生物學(xué)研究工具，在基因治療中具有良好的前景[14]。針對(duì)IGF1R基因的RNA干擾片段裝入特定質(zhì)粒中，再轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株，雖然作用時(shí)間有所延長(zhǎng)，但維持沉默效應(yīng)的時(shí)間有限[15]，因此本實(shí)驗(yàn)在載體選擇和實(shí)驗(yàn)方法上有新的嘗試，是一種有意義的探索。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定證實(shí)survivin-CMV肝癌特異性啟動(dòng)子啟動(dòng)的AFP-survivin-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R慢病毒載體構(gòu)建成功，對(duì)肝癌SMMC7721細(xì)胞和胎肝L-02細(xì)胞進(jìn)行體外研究表明，AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R能夠抑制肝癌SMMC7721細(xì)胞的生長(zhǎng)，并具有特異性。為腫瘤基因治療提供了理論依據(jù)和新的思路。

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