朱涵毅，王慧中，薛大偉

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

石斛繁殖技術(shù)研究進(jìn)展

朱涵毅，王慧中，薛大偉*

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

石斛是重要的觀賞和藥用植物，當(dāng)前石斛繁殖不能滿足市場(chǎng)需要.文章對(duì)目前石斛繁殖研究中存在的問(wèn)題進(jìn)行了分析，對(duì)現(xiàn)用的石斛繁殖方式進(jìn)行了比較和總結(jié)，以求為石斛繁殖提供方法和依據(jù)，并為后續(xù)研究提供思路，從而有效提高石斛繁殖的效率，達(dá)到保護(hù)瀕危物種和滿足市場(chǎng)需求的目的.

石斛；繁殖技術(shù)；組織培養(yǎng)

石斛蘭是蘭科植物中的第二大家族，有1 500～1 600個(gè)原生種，是我國(guó)古文獻(xiàn)中最早記載的蘭科植物之一，其花姿優(yōu)美，花色艷麗，花期較長(zhǎng)，多具芳香性，深受人們喜愛，在國(guó)際花卉市場(chǎng)占有重要的地位[1].石斛蘭不僅是重要的觀賞類花卉植物還具有重要的藥用價(jià)值.在《本草綱目》和《神農(nóng)本草經(jīng)》中石斛都被列為上品，我國(guó)76種石斛屬植物中有40種做藥用，著名的有金釵石斛、鐵皮石斛、霍山石斛等.但是石斛繁殖能力弱，其果實(shí)種子量大[2]，且種子無(wú)胚乳，在野生條件下常常需要蘭菌[3]的幫助才能萌發(fā)，加之市場(chǎng)需求的不斷擴(kuò)大，野生資源的過(guò)度采伐，石斛已被列為瀕危物種.而且石斛分株能力弱，繁殖系數(shù)低，繁殖速度慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足商品化生產(chǎn)的要求[4].因此尋找石斛的快速繁殖方法成為保護(hù)石斛物種和滿足市場(chǎng)需求的迫切要求.文章對(duì)近年來(lái)石斛快速繁殖和石斛組織培養(yǎng)的新進(jìn)展做了綜述以期為后續(xù)研究提供建議.

1 石斛組織培養(yǎng)研究

1.1 石斛組織培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)

植物組織培養(yǎng)由于可以較好地保證原品種的純度，繁殖系數(shù)高，培養(yǎng)周期短，且繁殖培養(yǎng)不受季節(jié)和生長(zhǎng)限制，在大規(guī)模生產(chǎn)中已得到廣泛使用.1922年，美國(guó)學(xué)者Kundson首次證明蘭花種子可以在無(wú)機(jī)鹽、糖、瓊脂組成的人工合成培養(yǎng)基上無(wú)需共生菌幫助萌發(fā)[5].由于Kundson的發(fā)現(xiàn)，使得石斛的組織培養(yǎng)進(jìn)入了新階段，在石斛快速繁殖中開始了大規(guī)模的應(yīng)用.

1.2 石斛組織培養(yǎng)的研究?jī)?nèi)容

目前對(duì)于石斛組織培養(yǎng)的研究包括外植體的篩選、培養(yǎng)基組成成分、培養(yǎng)條件等幾個(gè)方面.由于培養(yǎng)基組成成分可變量多，對(duì)石斛繁殖的影響大，因此培養(yǎng)基組成成分的研究一直是石斛組織培養(yǎng)的主要內(nèi)容.

1.2.1 外植體篩選

外植體篩選的一般原則：一般來(lái)說(shuō)外，植體年齡越小，分化程度越小，組織培養(yǎng)的成功率越高，因此一般選擇幼嫩的組織或器官作為外植體；除了外植體的年齡，還要考慮外植體所在部位，一般選取組織分裂能力強(qiáng)，容易形成愈傷組織的部分，如根尖、莖尖、芽及幼嫩的莖；此外，外植體的大小也是要考慮的因素，外植體過(guò)大，消毒困難，太小又容易死亡.在石斛組織培養(yǎng)中，雖然外植體的選擇研究較多，但方向比較單一，主要是在種子、莖尖、莖段中做選擇.也有少量研究中，通過(guò)幼芽或根尖作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo).

種子作為外植體的優(yōu)勢(shì)在于種子本身具有分化成完整植株的能力，萌發(fā)后成活率高.但是自然條件下，石斛種子自身很難萌發(fā)，需要在一些真菌幫助下才能萌發(fā)，因此石斛種子的萌發(fā)困難；而且大量種子同時(shí)萌發(fā)使得營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)激烈，并不利于大量繁殖，這就需要在種子萌發(fā)后對(duì)石斛進(jìn)行分株.黃勇[6]通過(guò)高錳酸鉀消毒的種子進(jìn)行人工培養(yǎng)，繁殖出了大量流蘇石斛，成活率在90%以上，克服了石斛種子萌發(fā)困難的問(wèn)題.

此外，莖尖也可以作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，莖尖跟種子一樣同樣具有較好的分化能力，在分化過(guò)程中形成愈傷組織和原球莖[7]，但是莖尖一般取材較小，成活率低[8].

石斛莖段雖然相對(duì)分化程度較高，但幼嫩的莖段還是可以作為外植體使用的，莫昭展等[9]就利用莖段進(jìn)行流蘇石斛莖段腋芽的誘導(dǎo)，通過(guò)不同激素配比也得到了大量石斛新植株.

另外，也有研究表明直接利用石斛原球莖切塊可以獲得大量新植株，蔣波等[10]就利用原球莖切塊進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得了鐵皮石斛新植株.但是目前石斛原球莖的誘導(dǎo)方法還不成熟，直接利用原球莖切塊還有一定困難.

1.2.2 培養(yǎng)基組成

1.2.2.1 培養(yǎng)基種類

由于石斛培養(yǎng)周期長(zhǎng)，各生長(zhǎng)階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求不同，為滿足石斛不同生長(zhǎng)階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)的不同需求，針對(duì)石斛不同階段的培養(yǎng)基組成都有一定程度的研究.因此石斛培養(yǎng)基也按照生長(zhǎng)階段分成生根培養(yǎng)基、原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基、原球莖增殖分化培養(yǎng)基、芽分化培養(yǎng)基.

1.2.2.2 培養(yǎng)基組成

石斛組織培養(yǎng)至今在培養(yǎng)基的組成上基本形成了一定的模式，都包含5個(gè)部分：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源、活性炭、天然提取物和激素.但是對(duì)于這5個(gè)不同組分所選用的具體成分和用量還沒(méi)有統(tǒng)一的觀點(diǎn).

1) 基礎(chǔ)培養(yǎng)基.主要包含大量元素、微量元素和鐵鹽等植物組織培養(yǎng)必需的成分.目前使用最廣泛的是MS，MS應(yīng)用面廣，兼容性好，大部分植物組織培養(yǎng)都可以采用這種培養(yǎng)基.1/2MS是MS的一個(gè)改進(jìn)，其中大量元素的濃度是MS中的一半，其他組分量不變.另外在石斛組織培養(yǎng)中還會(huì)使用B5、N6、VW、花寶一號(hào)等培養(yǎng)基，這些都是市場(chǎng)上使用比較成熟的培養(yǎng)基，與大規(guī)模生產(chǎn)結(jié)合更緊密.Suman K等[11]通過(guò)KL、VW、MS、W、Nitch、Mitra等幾種培養(yǎng)基進(jìn)行D.fimbriatum種子的離體培養(yǎng).發(fā)現(xiàn)MS、Nitch、VW較利于原球莖的發(fā)生，一般為4～5 d；而且Nitch、VW比較適合種子的萌發(fā).曾宋君等[12]以5種石斛為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在MS、KS、SH、VW、KC、改進(jìn)N6及PT培養(yǎng)基進(jìn)行離體培養(yǎng)得出了石斛最適培養(yǎng)基為N6.而后張超等[13]通過(guò)1/2MS、MS、VW、KC、花寶一號(hào)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，只有1/2MS和MS能利用文心蘭莖尖成功誘導(dǎo)出原球莖，而其他三者卻幾乎不誘導(dǎo).

2) 碳源.對(duì)于碳源的研究不是很多，主要配合基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行了一些相關(guān)的研究，普遍使用蔗糖作為碳源，但是也有用白糖和片糖作為碳源的報(bào)道.如陳春滿等[14]在對(duì)不同蝴蝶蘭品種進(jìn)行葉片誘導(dǎo)原球莖的研究中就是以白砂糖為碳源.對(duì)于碳源的用量一般在1%～3%，另外有報(bào)道[15]稱蔗糖的濃度會(huì)影響原球莖的分化和增殖，在蔗糖用量超過(guò)3%時(shí)，原球莖的分化停止，增殖也隨著蔗糖用量的升高而下降.

3) 活性炭.由于在組織培養(yǎng)過(guò)程中石斛容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，一般都在培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭.活性炭可以吸附非極性大分子和色素大分子，減少有害物質(zhì)的積累，一般加入0.5～10 g/L[16]，但是活性炭的吸附能力選擇性差，且會(huì)隨著溫度的改變而發(fā)生變化，甚至?xí)l(fā)生解吸附[17].所以對(duì)于活性炭的用量也沒(méi)有一個(gè)小范圍的建議量，大部分研究也只是按經(jīng)驗(yàn)或習(xí)慣加入了一定量的活性炭，通過(guò)對(duì)比確定活性炭最適濃度的實(shí)驗(yàn)暫時(shí)未見報(bào)道.

4) 天然提取物.天然提取物是除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基中已經(jīng)加入的有機(jī)質(zhì)外額外添加的一些有機(jī)物，在石斛繁殖研究中常用香蕉、馬鈴薯、椰乳和芋艿作為天然提取物來(lái)源.研究[18]表明:香蕉馬鈴薯提取物都能促進(jìn)石斛原球莖的分化，且香蕉提取物效果優(yōu)于馬鈴薯；椰乳對(duì)原球莖分化的促進(jìn)作用不明顯，但是對(duì)原球莖的增殖有較好的促進(jìn)作用.且椰乳促進(jìn)原球莖增殖過(guò)程中產(chǎn)生的原球莖能保持較好的外觀和形態(tài).

5) 激素.培養(yǎng)基的激素組成是目前石斛繁殖培養(yǎng)中研究最多的部分，主要針對(duì)激素的種類、激素用量及激素配比進(jìn)行研究.

在石斛繁殖培養(yǎng)基中常用的激素有IBA、NAA、6-BA、2,4-D、AD等，其中研究最多的是NAA和6-BA.NAA是使用最廣泛的生長(zhǎng)素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到巨大作用，在研究領(lǐng)域也是生長(zhǎng)素中的首選.部分研究表明NAA可以強(qiáng)化石斛植株，使新苗粗壯有力，但是對(duì)增殖卻沒(méi)有好處.蔣波等通過(guò)6-BA與NAA正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)加入2 mg/L的6-BA原球莖增殖最快，在此基礎(chǔ)上他們得出了石斛原球莖增殖最適培養(yǎng)基組成：MS+6-BA2 mg/L+NAA0.5 mg/L，實(shí)驗(yàn)表明在此培養(yǎng)基上進(jìn)行原球莖增殖實(shí)驗(yàn)，50 d后增殖倍數(shù)可以達(dá)到6倍以上.周俊輝等人的實(shí)驗(yàn)[19]表明：低濃度的6-BA對(duì)不定芽的增殖最好，隨著6-BA濃度的提高，不定芽增殖率和苗的健壯度隨之明顯下降；1 mg/L的NAA最適合原球莖的增殖.他們認(rèn)為在生產(chǎn)中，使用B5+6-BA0.1 mg/L+NAA0.5 mg/L+椰乳150.0 mg/L較適合石斛原球莖的誘導(dǎo)增殖，在石斛原球莖的增殖中提高NAA的質(zhì)量濃度為1 mg/L.但王春等[20]的實(shí)驗(yàn)表明6-BA質(zhì)量濃度以20 mg/L的增殖效果好于0.5 mg/L；黃萍萍等[21]使用的6-BA質(zhì)量濃度高達(dá)4 mg/L.

白美發(fā)等[22]實(shí)驗(yàn)表明：在石斛幼苗增殖中N6效果最好，B5次之，MS和1/2MS最差；椰乳作為天然添加物效果最好，香蕉和馬鈴薯效果相似.激素濃度對(duì)葉片原球莖形成的影響較大，BA質(zhì)量濃度高達(dá)20 mg/L對(duì)葉片原球莖的形成有顯著的影響.這與前人的研究有所不同，劉林等[23]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明BA用量低于10 mg/L時(shí)，外植體不能被誘導(dǎo)蝴蝶蘭形成PLB.對(duì)于白花紅唇和黃花紅唇品系，秦凡[24]則認(rèn)為BA5～10 mg/L較為合適，誘導(dǎo)率可達(dá)35%～37%，BA濃度過(guò)高所產(chǎn)生的原球莖反而下降.崔廣榮等[25]認(rèn)為BA4.0 mg/L+Ad2.0～4.0 mg/L+NAA1-2的激素組合較利于條紋花系品種的葉片原球莖誘導(dǎo),誘導(dǎo)率可達(dá)65%，這可能與品種的差異有關(guān)，但在對(duì)各品種的研究中均有類似情況，說(shuō)明該現(xiàn)象具有一定的普遍意義，值得進(jìn)一步研究.

1.2.3 培養(yǎng)條件

此外，在石斛組織培養(yǎng)繁殖研究中還包括培養(yǎng)方式和光照時(shí)間和光照周期等.培養(yǎng)方式主要是液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基2種，目前在石斛培養(yǎng)中以固體培養(yǎng)為主，液體培養(yǎng)的研究不多，如莫昭展等也通過(guò)液體培養(yǎng)的方式進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng).在光照和光照周期上現(xiàn)在基本形成統(tǒng)一，一般都采用24 h為周期，每天光照12 h.但也有少量研究中采用光照8 h進(jìn)行培養(yǎng).

2 石斛的其他繁殖手段

2.1 分株繁殖

石斛通常成叢生長(zhǎng)，有數(shù)個(gè)或多個(gè)肉質(zhì)的長(zhǎng)莖，莖上有節(jié).最簡(jiǎn)單的分株繁殖方法就是從叢生莖的基部切開或掰開，一分為二，分別種于不同的盆中，即可達(dá)到分株的目的.有些石斛種類在莖的頂端或基部生有小植株.小植株根、莖、葉俱全，待長(zhǎng)到一定程度時(shí)，可切下栽于盆中；也有的種類可以扦插繁殖，亦即將肉質(zhì)莖切成許多小段，每段帶2～3節(jié)，插在用泥炭、水苔、腐殖質(zhì)組成的基質(zhì)中，置于濕潤(rùn)、溫暖、蔭蔽的環(huán)境中，經(jīng)過(guò)幾個(gè)星期后可以看到長(zhǎng)出l～2個(gè)小根，此時(shí)可移栽于小盆中，將這些新芽進(jìn)行分株既可以緩解生長(zhǎng)帶來(lái)的競(jìng)爭(zhēng)，又可以獲得新的植株.新芽分株一般在每年3月份，在新芽尚未萌發(fā)之前進(jìn)行.方法操作簡(jiǎn)單，植株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良.但是每年只能進(jìn)行一次分株，且每次分株獲得的新植株數(shù)量有限，與龐大的市場(chǎng)需求相比顯得杯水車薪[26].

2.2 扦插繁殖

扦插繁殖可以在盛夏和嚴(yán)冬以外的季節(jié)進(jìn)行，相對(duì)分株法限制相對(duì)較少，只要不在開花期就可以挑選充實(shí)的石斛蘭假鱗莖進(jìn)行扦插繁殖.選取未開花的石斛蘭假鱗莖，用消毒過(guò)的刀具從根際剪下后，按2～3節(jié)的長(zhǎng)度剪切成小段，切口可涂適量草木灰，豎直扦插在用水苔和蛇木屑(水苔：蛇木屑=7：3)混合制成的扦插床上進(jìn)行，待生根發(fā)芽后便可移栽入盆.栽種時(shí)將新芽連帶老莖一起栽種在盆中央，深度以水草剛好蓋過(guò)根系為度.這種方法在一定程度上增加了繁殖數(shù)量，但還是不能滿足市場(chǎng)需求[27].

2.3 高芽繁殖

高芽繁殖是石斛蘭的一種特殊的繁殖方式.部分假鱗莖在成熟后會(huì)在頂端處的芽眼處長(zhǎng)出高芽，高芽其實(shí)就是一種具有根莖葉的小植株.高芽繁殖的操作也比較簡(jiǎn)單方便，待小植株長(zhǎng)至高8～10 cm，根數(shù)3～4條時(shí)，用消毒過(guò)的刀剪，將小植株切下，用70%的代森錳鋅等可濕性粉劑殺菌處理傷口，再將芽放在盆中央，根向四周展開，慢慢填入植料即可.由于從假鱗莖上獲得高芽的量遠(yuǎn)大于分株方式，因此，高芽方式可以在一定程度上獲得更多的新植株[28].

2.4 試管苗繁殖

試管苗繁殖是近年來(lái)投入規(guī)模生產(chǎn)的有效方式，現(xiàn)在石斛中最常用的組織培養(yǎng)也屬于試管苗繁殖的一種，除了組織培養(yǎng)還有無(wú)菌播種等[29].

無(wú)菌播種繁殖可以在短期內(nèi)獲得大量的種苗，為新品種的選育提供了基礎(chǔ)，缺點(diǎn)是種苗性狀差異大.而組織培養(yǎng)，利用外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織或原球莖進(jìn)而分化成完整新植株.通過(guò)組織培養(yǎng)可以獲得與母體相同性狀的大量高整齊度的新植株，是現(xiàn)階段經(jīng)濟(jì)有效的快速繁殖法，也是工廠化育苗的重要途徑[30].

3 問(wèn)題與展望

3.1 研究?jī)?nèi)容多而雜.在培養(yǎng)基研究中同樣是對(duì)激素的研究，但不同文獻(xiàn)研究材料有的用的是種子，有的用的是莖段；研究對(duì)象有的是針對(duì)原球莖的增殖，有的是針對(duì)不定芽增殖.同樣的研究?jī)?nèi)容沒(méi)有形成系統(tǒng)性和一致性.后期石斛繁殖研究應(yīng)該在單一問(wèn)題中采用相同材料及相同對(duì)象進(jìn)行研究，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，減少分歧.

3.2 不同文獻(xiàn)之間得出結(jié)論差異很大，甚至沖突，亟待綜合性的實(shí)驗(yàn)解決分歧.如王春[20]，黃萍萍[21]，周俊輝等[19]的實(shí)驗(yàn)，內(nèi)容相似但得出的結(jié)論卻有很大差異，在6-BA的最適濃度上沒(méi)有得出統(tǒng)一的意見.

3.3 沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn).在原球莖誘導(dǎo)、增殖分化等實(shí)驗(yàn)中，單純地做視覺上橫向比較，很少用數(shù)據(jù)說(shuō)明問(wèn)題，很難與其他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)的比較，只有少量如褐化棵數(shù)等有明確數(shù)值對(duì)比.此外，由于沒(méi)有統(tǒng)一的衡量標(biāo)準(zhǔn)，使得很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能直接比較，不得不在下一次實(shí)驗(yàn)中重新試驗(yàn)，導(dǎo)致大量重復(fù)勞動(dòng).因此石斛繁殖研究中亟需形成一套穩(wěn)定可靠的衡量體系，可以簡(jiǎn)化現(xiàn)有的研究工作，得出較為系統(tǒng)的結(jié)論，使得大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行比對(duì)，縮減工作量，減少重復(fù)勞動(dòng).

3.4 石斛繁殖的研究到目前為止還只有在石斛培養(yǎng)基上形成一個(gè)相對(duì)權(quán)威的基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，后期研究應(yīng)著眼于尋找一個(gè)明顯優(yōu)于其他的培養(yǎng)體系，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)化和改進(jìn).另外保持其他非傳統(tǒng)培養(yǎng)基的研究和開發(fā)，以期在非傳統(tǒng)培養(yǎng)基體系中取得新突破，找到適合石斛快速繁殖的培養(yǎng)體系.

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ResearchesontheReproductionTechniquesofDendrobium

ZHU Han-yi,WANG Hui-zhong,XUE Da-wei

(College of Life and Environmental Sciences,Hangzhou Normal University,Hangzhou 310036,China)

Dendrobiumplants are economically important flowers in horticulture as well as the most valuable medicinal herbs with wide clinical applications in traditional Chinese medicine.However,Dendrobiumproduction can not meet the current needs of the market.To provide methods and technologies for the reproduction ofDendrobiumas well as the mentality of follow-up study,this paper gave a brief review of the reproduction technologies ofDendrobiumsummarized and compared the current reproduction technologies ofDendrobiumand analyzed the current problems in the researches onDendrobiumreproduction to find a way to improve the efficiency ofDendrobiumreproduction,protect endangeredDendrobiumand meet the market demands.

Dendrobium; reproduction techniques; tissue culture

2011-01-12

杭州市科技局科研基金項(xiàng)目(20091832B10).

朱涵毅(1988—)，男，江蘇宜興人，遺傳學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究.

*通信作者：薛大偉(1978—)，男，山東蒙陰人，副教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究.E-mail:dwxue@hznu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-232X.2011.05.012

Q945

A

1674-232X(2011)05-0449-05