黃至澄，徐黔寧，閆李俠，陳保文，王國(guó)治

(1、臺(tái)州市第一人民醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318020；2、中國(guó)藥品生物制品檢定所，北京 100050)

常見分枝桿菌種內(nèi)不同株之間16S rRNA基因和16S-23S rRNA ITS序列分析結(jié)果的比較

黃至澄1，徐黔寧1，閆李俠，陳保文2，王國(guó)治2

(1、臺(tái)州市第一人民醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318020；2、中國(guó)藥品生物制品檢定所，北京 100050)

目的針對(duì)常見分枝桿菌不同株對(duì)其基因序列進(jìn)行分析，比較分析結(jié)果。 方法 利用16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS(轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列)分析法分別對(duì)97株共7種DSMZ/ATCC引進(jìn)的常見分枝桿菌進(jìn)行種內(nèi)不同株之間基因差異性分析，對(duì)比兩種分型結(jié)果的異同。結(jié)果16S rRNA基因可將13株草分枝桿菌分為3個(gè)型別，18株偶發(fā)分枝桿菌分為6個(gè)型別，17株恥垢分枝桿菌分為4個(gè)型別，8株戈登分枝桿菌分為3個(gè)型別，9株龜分枝桿菌龜亞種分為3個(gè)型別，15株堪薩斯分枝桿菌分為2個(gè)型別，17株產(chǎn)鼻疽分枝桿菌分為1個(gè)型別；而16S-23S rRNA ITS可依次將上述分枝桿菌分為3個(gè)、15個(gè)、7個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、5個(gè)型別。結(jié)論16S rRNA Gene分析和16S-23S rRNA ITS分析均是分枝桿菌基因型分析的可靠方法，此外，16S-23S rRNA ITS的種內(nèi)多態(tài)性高于16S rRNA Gene。

分枝桿菌；16S rRNA；16S-23S rRNA ITS(轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))；基因型

16 S rRNA基因作為原核生物分類的分子標(biāo)志，已得到廣泛應(yīng)用，但因序列較長(zhǎng)，直接測(cè)序困難，常以16S rRNA部分片段作為細(xì)菌鑒定標(biāo)志。16S-23S rRNA ITS(轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列，進(jìn)化速率比16S rRNA大10倍，在細(xì)菌的不同屬種中拷貝數(shù)、堿基排列順序以及內(nèi)含的tRNA基因的數(shù)量和種類不同，序列大小比16S rRNA更具直接測(cè)序優(yōu)勢(shì)。如果兩種結(jié)合，菌種鑒定效果較好。這種方法對(duì)于分枝桿菌同樣適用。但是，現(xiàn)在較少有將兩者結(jié)合鑒定種內(nèi)參考菌株，它們對(duì)種內(nèi)不同株的鑒別效果還不明確，且少數(shù)分枝桿菌的16S rRNA和部分16S-23S rRNA ITS沒有在基因庫(kù)中公布[1]，以至于新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌無(wú)法用序列比對(duì)區(qū)分。用此方法，我們對(duì)德國(guó)微生物和細(xì)胞保藏中心 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)和中國(guó)微生物保藏中心(China Collection of Microorganisms Culture Center，CMCC)的7種共97株分枝桿菌的參考菌株分別予以序列分析，為臨床鑒定提供對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株：實(shí)驗(yàn)所用分枝桿菌7種共97株均由ATCC或DSMZ引進(jìn)并在中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心保藏。

1.1.2 PCR引物和測(cè)序引物：參考文獻(xiàn)[2]中使用的引物。

1.2 方法 DNA制備、PCR擴(kuò)增、核苷酸序列分析均參考文獻(xiàn)[2]中的方法。

2 結(jié)果

2.1 分枝桿菌基因擴(kuò)增：成功完成97株分枝桿菌16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS PCR擴(kuò)增；與目的條帶大小相符。

2.2 分枝桿菌基因序列測(cè)定：完成97株分枝桿菌16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS的上、下游序列測(cè)定，得到其雙向拼接結(jié)果。

2.3 在對(duì)7種包括97株分枝桿菌進(jìn)行種內(nèi)不同株的序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)16S rRNA Gene分析可將13株草分枝桿菌分為2個(gè)型別，相似性百分比為96～100%；18株偶發(fā)分枝桿菌分為6個(gè)型別，相似性百分比為90～100%；17株恥垢分枝桿菌分為4個(gè)型別，相似性百分比為91～100%；8株戈登分枝桿菌分為3個(gè)型別，相似性百分比為91～100%；9株龜分枝桿菌龜亞種分為3個(gè)型別，相似性百分比為97～100%；15株堪薩斯分枝桿菌分為2個(gè)型別，相似性百分比為99－100%；17株產(chǎn)鼻疽分枝桿菌分為1個(gè)型別，相似性百分比為100%。而16S-23S rRNA ITS可依次將上述分枝桿菌分為3個(gè)，15個(gè)，7個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，3個(gè)，5個(gè)型別；相似性百分比依次為74～100%，53～100%，49～100%， 86～100%，65～100%，90～100%，77～100%

3 討論

16 S rRNA，16S-23S rRNA ITS分析可將細(xì)菌鑒別到屬與種，比較RAPD(隨機(jī)引物PCR)或RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析)該方法兼顧了凝膠電泳與測(cè)序分析，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序用于細(xì)菌鑒定。通過核酸序列分析進(jìn)行細(xì)菌鑒定的空間很大，尤其對(duì)難培養(yǎng)細(xì)菌和新病原微生物的發(fā)現(xiàn)意義重大，但是由于操作復(fù)雜、直接測(cè)序結(jié)果不穩(wěn)定、需要特殊投備投入、試劑成本高等原因，該技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用仍然有限。國(guó)內(nèi)已有不少研究將16S rRNA，16S-23S rRNA ITS分析用于臨床上各種致病菌的鑒定[3-10]。我們對(duì)DSMZ和CMCC的7種共97株分枝桿菌的16S rRNA Gene、16S-23S rRNA ITS序列進(jìn)行了比對(duì)，主要是種內(nèi)各株之間差異性：相對(duì)16S rRNA Gene而言，16S-23S rRNA ITS的種內(nèi)多態(tài)性較高，即前面我們提到的，16S rRNA Gene高度保守而相對(duì)變異，16S-23S rRNA ITS則高度變異而相對(duì)保守。如果用16S-23S rRNA ITS來(lái)鑒定，可以將這些細(xì)菌種內(nèi)各株分為更多的基因型，據(jù)此，就使鑒定達(dá)到株的水平。兩種分型的結(jié)果有相似之處，即16S rRNA Gene能鑒別的菌株，16S-23S rRNA ITS同樣可以鑒別；但也稍有區(qū)別，即16S-23S rRNA ITS還可以鑒別16S rRNA Gene不能鑒別的菌株，例如：在恥垢分枝桿菌中兩種方法都可以把93428、93397、93381各分為一型，但 16S-23S rRNA ITS還可以把95023、93426、93400分別與其他型分開，根據(jù)16S rRNA Gene卻不能達(dá)到這個(gè)效果。在兩者均能鑒別的菌株中，16S rRNA Gene的相似性百分比明顯高于16S-23S rRNA ITS：在恥垢分枝桿菌中93428與93397的16S-23S rRNA ITS相似性為88%；93397與 93381的相似性為 52%；93428與93381的相似性為53%；而相對(duì)應(yīng)的16S rRNA Gene的相似性分別為96%、91%、91%。因此，鑒于兩種基因不同的特點(diǎn)，我們認(rèn)為16S rRNA Gene不適合做種內(nèi)不同株之間的分型和鑒定區(qū)分，16S-23S rRNA ITS則更適合。

分枝桿菌16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS序列分析是一種重要的流行病學(xué)工具，對(duì)于暴發(fā)流行時(shí)傳染源的追蹤、解釋分枝桿菌病的復(fù)發(fā)和再染以及實(shí)驗(yàn)室交叉污染等方面的研究具有十分重要的意義。現(xiàn)有一些報(bào)道指出16S rRNA Gene和16S-23S rRNA ITS在臨床致病菌鑒定中有較大的價(jià)值。但是，將其用于臨床還有一段距離，其原因是缺乏一個(gè)可靠的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，國(guó)內(nèi)的研究者，比如李國(guó)利[1]，彭濤[11]等做臨床分離株鑒定時(shí)，一些分枝桿菌在GenBank序列檢索中找不到完全一致的匹配序列，這說(shuō)明分枝桿菌基因數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)不全，有些數(shù)據(jù)信息可能還有錯(cuò)誤，因此，數(shù)據(jù)庫(kù)資料不全導(dǎo)致新發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌無(wú)法鑒定。針對(duì)DSMZ的7種常見分枝桿菌的所有菌株，本研究進(jìn)行了上述兩種不同基因片段的測(cè)序和分析，所用菌株都來(lái)自菌種庫(kù)，是已知菌株，上、下游測(cè)序保證了序列的準(zhǔn)確性，所以，其序列可作為臨床分離株鑒定的標(biāo)準(zhǔn)參考序列。這些序列提交至GenBank中就能補(bǔ)充基因數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外資源共享，為分枝桿菌的鑒定提供依據(jù)。

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Analysis of the genotypes among different strains of common Mycobacteria based on 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences

HUANG Zhicheng,XU Qianning,YAN Lixia,et al.Taizhou First People＇s Hospital,Zhejiang Taizhou 318020,China

ObjectiveTo analyze the genotypes of different strains of common Mycobacteria.MethodsThe different genes from 97 strains introduced Mycobacteria composed of 7 species DSMZ/ATCC were detected using 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA internal transcription space (ITS)sequence method.Results13 M.phlei strains,18 M.fortuitum strains,17 M.smegmatis strains,8 M.gordonae strains,9 M.chclonae strains,15 M.kansasii strains and 17 M.farcinogenes strains could be discriminated to 3,6,4,3,3,2 and 1 genotypes by16S rRNA gene;and discriminated to 3,15,7,3,4,3 and 5 genotypes by 16S-23S rRNA ITS gene respectively.Conclusions The analysis of 16S rRNA gene and 16S-23S rRNA ITS gene sequence is reliable method to discriminate Mycobacteria.The polymorphism of 16S-23S rRNA ITS gene is higher than that of 16S rRNA gene in intraspecies of Mycobacteria.

Mycobacteria；16S rRNA；16S-23S rRNA internal transcription space；Genotype

R378.91,R446.5

A

1674-1129(2011)06-0587-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.06.002

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題（艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治-重大傳染病診斷產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)綜合技術(shù)平臺(tái)2009ZX10004-805)

黃至澄，男，碩士，臺(tái)州市第一人民醫(yī)院急診科。

陳保文，Email:tbtestlab@163.net