(勝利油田中心醫(yī)院,山東東營(yíng) 257034)

近年來隨著廣譜抗生素的使用,鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗生素的耐藥性逐年增加[1]。2005年 1月～2010年 6月,本研究對(duì) 309株鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥表型和常見 β-內(nèi)酰胺酶基因類型進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 309例鮑曼不動(dòng)桿菌菌株分離自勝利油田中心醫(yī)院 ICU病房確診鮑曼不動(dòng)桿菌感染的患者痰、創(chuàng)面分泌物、血、尿、膽管引流液、大便、腦脊液、胸水、腹水。使用 VITEK60細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀及NFC鑒定卡鑒定菌種,標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌 ATCC27853?？咕埰瑏啺放嗄?IPM)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林 /他唑巴坦(TZP)、氨芐西林/舒巴坦 (ASM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢哌酮 /舒巴坦(SCF)、阿米卡星(AK)、復(fù)方新諾明(SXT)、左旋氧氟沙星(LEV)、氨曲南(ATM)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CRO)。M-H培養(yǎng)基。

1.2 鮑曼不動(dòng)桿菌菌株耐藥表型檢測(cè) 采用 K-B紙片擴(kuò)散法。實(shí)驗(yàn)方法和判讀標(biāo)準(zhǔn)均按照美國(guó) NCCLS規(guī)定(M 100-S21-2011版)進(jìn)行。

1.3 鮑曼不動(dòng)桿菌菌株 β-內(nèi)酰胺酶類型檢測(cè) 采用改良三維試驗(yàn)大平皿法。以 Nitrocefin紙片鑒定出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性結(jié)果,1 h后無顏色變化為陰性。以超聲破碎法制備 β-內(nèi)酰胺酶粗提物,頭孢硝噻吩顯色法檢測(cè)提取物。按照文獻(xiàn)[2]的方法操作,加入待測(cè)樣本,放置平皿于 35℃溫箱過夜培養(yǎng) 18～24 h,平皿上抑菌圈出現(xiàn)變形為陽(yáng)性,反之為陰性。

1.4 鮑曼不動(dòng)桿菌菌株 β-內(nèi)酰胺酶基因類型的檢測(cè) 分別采用 Qiagen Plasmid Minikit及手工堿裂解法提取質(zhì)粒。①單一引物 PCR擴(kuò)增法檢測(cè) OXA型β-內(nèi)酰胺酶基因 OXA-23、OXA-24,方法參考文獻(xiàn)[3]。②多重引物 PCR擴(kuò)增法檢測(cè) ESBLs和AmpC酶基因,ESBLs的 3對(duì)引物及 AmpC的 6對(duì)引物設(shè)計(jì)及 PCR反應(yīng)步驟參考文獻(xiàn)[4]。將所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察,并用凝膠成像系統(tǒng)掃描成像進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì) 13種抗菌藥物的耐藥率2005年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì) IPM、AK、SXT、ASM、FEP、CAZ、TZP、PIP、ATM、CTX、CRO的耐藥率分別為5.0%、15.2%、20.3%、21.4%、18.8%、20.5%、30.0%、38.4%、18.8%、18.6%、19.9%;2006年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì) IPM、AK、SXT、ASM、FEP、CAZ、TZP、PIP、SCF、LEV、ATM、CTX、CRO的耐藥率分別為6.0%、21.4%、25.8%、34.2%、20.5%、14.3%、40.3%、50.4%、10.3%、11.3%、20.5%、11.9%、14.5%,2007年分別為 3.0%、19.5%、24.1%、42.5%、25.8%、30.4%、33.3%、46.3%、29.1%、19.2%、25.8%、45.6%、31.1%,2008年分別為2.7%、22.5%、27.6%、32.6%、35.4%、40.2%、47.1%、61.2%、38.8%、22.6%、35.4%、46.6%、39.6%,2009年分別為 3.6%、23.3%、25.3%、23.1%、42.8%、36.1%、56.2%、77.4%、47.2%、34.5%、42.8%、33.2%、28.9%,2010年分別為3.2%、29.5%、35.1%、23.5%、40.2%、34.2%、33.2.%、58.2%、39.1%、23.1%、40.2%、30.6%、33.5%。

2.2 菌株 β-內(nèi)酰胺酶類型檢測(cè)結(jié)果 309株鮑曼不動(dòng)桿菌中,294株產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶。其中 171株能經(jīng)改良三維試驗(yàn)大平皿法進(jìn)行酶分型:單獨(dú)產(chǎn)碳青霉烯酶 6株、產(chǎn) EsBLsls 23株、產(chǎn) AmpC酶 8株 ,產(chǎn)IRTsls 27株;同時(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶和 ESBLs的有 8株,產(chǎn) AmpC酶和 ESBLs的有 13株,同時(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶和 IRTs的有 10株 。

2.3 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果 在 IMP中介或耐藥的 53株鮑曼不動(dòng)桿菌中,有 11株擴(kuò)增到 blaOXA-23。對(duì)CTX/CAZ均耐藥的 183株鮑曼不動(dòng)桿菌中,產(chǎn) ESBLs組 75株,多重 PCR檢測(cè)到 12株陽(yáng)性,分別攜帶blaCTX-M-13、blaCTX-M-14各 3株,同時(shí)攜帶blaSHV和 blaCTX-M-1共 6株 ;產(chǎn) ESBLs組 108株中多重 PCR均陰性。對(duì) FOX中介或耐藥的 281株鮑曼不動(dòng)桿菌中,產(chǎn) AmpC酶組 36株,多重 PCR僅檢測(cè)到 3株 AmpC基因陽(yáng)性。不產(chǎn) Ampc酶組 245株,多重 PCR檢測(cè)到 5株攜帶 blaDHA。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌以其生存能力強(qiáng)、耐藥率高已成為重要的院內(nèi)感染條件致病菌,可引發(fā)肺部院內(nèi)感染、敗血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎等[5]。

本研究中,鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì) β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率除 IPM外均在 27.9%～77.9%。其對(duì)頭孢SCF及 ASM耐藥率相對(duì)較低,因?yàn)槭姘吞箍梢种?β-內(nèi)酰胺酶,又可通過作用于細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)而在體內(nèi)增強(qiáng)其抗藥活性[6]。氨基糖甙類抗生素中,AK耐藥率較低(29.5%),但該藥單獨(dú)使用療效不佳。LEV耐藥率達(dá)到 39.3%,這與近年來臨床大量使用這類藥物有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì) IPM耐藥率最低(＜3.6%),可能與該藥臨床應(yīng)用時(shí)間較短,且抗菌作用強(qiáng)、與第三代頭胞菌素?zé)o交叉耐藥性、對(duì)多數(shù) β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定有關(guān)[6]。

本研究采用 OXA-23、OXA-24兩種酶基因引物將對(duì) IPM中介或耐藥的 53株鮑曼不動(dòng)桿菌的基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn),11株 blaOXA-23陽(yáng)性,blaOXA-24陰性。而感染攜帶 blaOXA-23基因的鮑曼不動(dòng)桿菌(33株)者,其臨床資料完整的 25例中有 23例被診斷為院內(nèi)感染,說明存在對(duì) IPM耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染流行,且基因型為blaOXA-23。產(chǎn) OXA-23型和 0XA-6型碳青霉烯酶可能是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì) IPM、美羅培南等碳青霉烯類藥物耐藥的主要機(jī)制[7]。

目前已知大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等易生產(chǎn) ESBLs,AmpC酶由腸桿菌科細(xì)菌或綠膿假單胞菌的染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生。本研究對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的 ESBLs、AmpC酶兩種 β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行多重 PCR檢測(cè),僅發(fā)現(xiàn) 3株 ESBLs基因型陽(yáng)性,5株 AmpC酶基因型陽(yáng)性,兩者陽(yáng)性率均低。說明鮑曼不動(dòng)桿菌中這些基因型者可能屬于散發(fā),可能與耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染流行無關(guān)。然而該結(jié)果提示腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌向鮑曼不動(dòng)桿菌質(zhì)粒的水平傳遞已經(jīng)存在。

此外,本研究對(duì)于整合子所導(dǎo)致細(xì)菌多藥耐藥檢測(cè)沒有涉及。整合子可造成多種耐藥基因在不同菌株其至不同菌種間的水平轉(zhuǎn)移,對(duì)其進(jìn)行研究,也有助于做好細(xì)菌耐藥性的監(jiān)控工作[8]。

[1]潘曉龍,周東升,富錚,等.鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥監(jiān)測(cè)及氨基糖苷修飾酶基因分布[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,28(4):298-303.

[2]Jiang XF,Hong XH,Sun JY,et al.Analysis of beta-lactamase in multi-resistantpseudomonasaeruginosa[J].Chin JMicrobiol Immunol,2002,22(4):443-446.

[3]Bou G,Oliver A,Martinez-Beltran J.OXA-24,a novelclass Dβlactamase with carbapenemaseactivity in an acinetobacter baumannii clinical strain[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44:1556-1561.

[4]Lewis JS,Herrera M,Wickes B,et al.First reportof the emergence of CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs)as the predominant ESBL isolated in a U.S.health care system[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51:4015-4021.

[5]朱旭慧,孫自鏞,簡(jiǎn)翠,等.不動(dòng)桿菌屬的耐藥性分析[J].中國(guó)抗感染化療雜志,2005,5(6):342-345.

[6]王春新,謝國(guó)強(qiáng),嚴(yán)子禾,等.耐亞胺培南細(xì)菌的臨床分離及耐藥譜分析[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè),2005,26(9):666-667.

[7]周東升,潘曉龍,王傳發(fā).耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶基因型研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(7):631-633.

[8]唐吉斌,周東升,徐元宏.整合子在鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥中的作用研究[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010,31(5):420-424.