李一生，朱長清

（1.黑龍江省綏化市北林區(qū)畜牧局，黑龍江 綏化 152000；2.北京德佳牧業(yè)科技有限公司，北京 100098）

日本腦炎病毒（JEV）又稱乙型腦炎病毒，由乙型腦炎病毒引起的流行性乙型腦炎簡稱乙腦。乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）成員，乙型腦炎病毒基因為單股正鏈RNA，病毒顆粒呈球形，有包膜，直徑40～60 nm，病毒粒子呈20面體對稱。豬是乙腦病毒的中間宿主，帶毒豬是本病的傳染源，臨床上以引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎為特征。乙腦是一種人畜共患的自然疫源性疾病，能夠引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，對人類危害巨大，據(jù)統(tǒng)計全球每年平均發(fā)病50 000人，死亡15 000人，尤其在農(nóng)村地區(qū)，死亡率更大。

1 JEV的流行特點

日本腦炎病毒于1870年在日本首先發(fā)現(xiàn)[1]。于1935年從患有乙型腦炎死亡病人、死馬的腦組織和蚊蟲中分離到該病毒，首次確定了乙型腦炎的病原。我國于1949年在北京首次分離得到乙腦病毒，隨后在我國其他地區(qū)也相繼分離到該病毒[2]。乙型腦炎病毒的流行地域很廣，主要流行于遠(yuǎn)東及東南亞國家和地區(qū)[3－4]。韓國、泰國、印度尼西亞的爪哇島、臺灣、俄羅斯西伯利亞的濱海地區(qū)等相繼有乙腦的報道，在印度西北和西南的Kerala和Haryana州也有報道乙腦的流行[5－7]。近年澳大利亞本土和美國的關(guān)島地區(qū)也出現(xiàn)乙腦病例[8]。表明該病的流行區(qū)域在不斷擴(kuò)大，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織已把JEV疫苗確定為優(yōu)先研究和開發(fā)的項目之一，如何選擇合適的乙型腦炎疫苗防治JEV感染，是當(dāng)今人們在該領(lǐng)域研究的熱點問題，近年來我國對JEV進(jìn)行了大量研究。在JEV活疫苗的研究方面我國居于世界領(lǐng)先水平。余永新等研究成功的JEV活疫苗SA14－14－2株已大量用于人群，這一成果使我國的乙腦發(fā)病率顯著下降[9]。因此深入研究中國流行乙腦病毒的分子生物學(xué)，對于了解亞洲乃至全世界的乙腦病毒的特性具有舉足輕重的作用。

2 JEV結(jié)構(gòu)蛋白的特點

目前還沒有治療乙腦的有效藥物，接種乙腦疫苗是控制乙腦的重要措施。國際上廣泛使用的乙腦疫苗主要是滅活苗，我國使用的主要是SA14－14－2株原代地鼠腎細(xì)胞減毒活疫苗。這兩種疫苗都存在一些缺點，諸如過敏反應(yīng)，造價昂貴等，因此研究一種經(jīng)濟(jì)、有效、安全的疫苗成為必然趨勢。

E蛋白是乙腦病毒的囊膜蛋白，已經(jīng)證明E蛋白是與細(xì)胞膜受體相結(jié)合而與細(xì)胞膜融合使病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要蛋白，與病毒的吸附、侵入、致病性、組織嗜性、血凝反應(yīng)、血清特異性和誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等緊密相關(guān)。乙腦病毒E基因編碼病毒包膜糖蛋白，糖蛋白的活性區(qū)域由3個Domain、411 個氨基酸殘基組成[10－11]。Kolaskar等學(xué)者的研究結(jié)果顯示，乙腦病毒包膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)主要由三個結(jié)構(gòu)域DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ組成，結(jié)構(gòu)域Ⅰ為E1～E51、E137～E196、E293～E311；結(jié)構(gòu)域 Ⅱ 為 E52～E137、 E197～E292； 結(jié) 構(gòu) 域 Ⅲ 為E310～E411[8]。結(jié)構(gòu)域Ⅲ獨立地在病毒表面折疊成為疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)，由于這種構(gòu)象，許多抗原中和表位都集中于這一結(jié)構(gòu)域。其中DomainⅢ參與受體結(jié)合，是重要的抗原決定簇；DomainⅢE327位點又是決定抗原性的關(guān)鍵位點[11]。抗原中和表位的研究主要集中于結(jié)構(gòu)域Ⅲ，以往學(xué)者對這一區(qū)域的研究顯示，E333、E373～395以及E306、E331和E387都與病毒的中和活性直接相關(guān)[12－14]。通過強弱毒株E蛋白氨基酸序列分析，E蛋白上E138、E176、E315、E439位點上氨基酸的突變在病毒減毒過程中起了重要作用[15]。確定JEV毒性的10個關(guān)鍵性氨基酸的位置均在E蛋白上，分別位于E107、E135、E138、E176、E177、E232、E244、E264、E279、E315、E439、E447。Wu 等利用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)，從肽庫中篩選對病毒單抗高親和力的肽段，確定病毒在結(jié)構(gòu)域Ⅲ中的中和位點主要集中在 E337～E345、E377～E382、E397～ E403這3個區(qū)域內(nèi)[13]。在這一區(qū)域發(fā)生的變異會導(dǎo)致抗原性的改變，甚至影響抗原與中和抗體的結(jié)合反應(yīng)，而中和抗體在預(yù)防乙腦中起主導(dǎo)作用[16]。

3 JEV毒株分類的特點

國際上乙腦病毒的基因分型采用Chen等學(xué)者建立的基因分型法，選擇位于PrM區(qū)的乙腦病毒基因組456～695位的240個核苷酸長度序列作為基因分型的基礎(chǔ)[17－18]。由于乙腦病毒在這一該區(qū)段所受進(jìn)化壓力較小，可以采用該區(qū)段來反映乙腦病毒的自然進(jìn)化狀況。乙腦病毒以此分為泰國北部及柬埔寨地區(qū)分離的毒株屬于基因Ⅰ型；來自于泰國南部、馬來西亞、印度尼西亞的毒株形成基因Ⅱ型；來自于日本、中國等地區(qū)的毒株屬于基因Ⅲ型；部分印度尼西亞的JKT6468毒株獨自形成了基因IV型[17]。我國病毒學(xué)者曾分離出多株乙腦病毒，且研究證實這些毒株間免疫原性存在差異，而以SA14－14－2株為疫苗毒株生產(chǎn)疫苗，應(yīng)用于JEV的疾病控制起到了一定的保護(hù)作用[6]。

乙型腦炎病毒的分類有著明顯的地域性，相同的國家和地區(qū)分離到的毒株的相似性很高[19－21]。日本于1935年分離第一株JEV Nakayama及其后分離JEV都屬于基因Ⅲ型，期間1991年分離株JaOArK36291屬于基因Ⅰ型，從1994年后分離的所有毒株均屬于基因Ⅰ型[22]。韓國報道1991年前所分離的JEV屬于基因Ⅲ型，1994年的分離的2個毒株屬于基因Ⅰ型[23]。我國以往分離的JEV屬于基因Ⅲ型[24]。但是近十多年來，乙腦病毒基因型的地區(qū)有了新的變化，2001年從上海市奉賢縣采集的三帶喙庫蚊中新分離的7株JEV屬于基因Ⅰ型[25]。2002和2007年在遼寧先后分離到基因Ⅰ型乙腦病毒，也是東北地區(qū)首次分離到基因Ⅰ型的乙腦病毒[26－27]。2000年澳大利亞分離的病毒株分別屬基因Ⅰ、Ⅱ型并報道首例乙腦病毒的分子生物學(xué)特性[5]。

4 JEV的治病機(jī)制及診斷方法

4.1 治病機(jī)制

當(dāng)攜帶乙腦病毒的蚊蟲叮咬動物或人后，病毒隨著蚊蟲唾液進(jìn)入皮下，先在局部毛細(xì)血管壁內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴結(jié)等處的細(xì)胞中增殖，隨后少量病毒進(jìn)入血流形成短暫的第一次病毒血癥，但僅有少數(shù)感染者發(fā)展成為顯性感染[28－30]。感染后是否發(fā)病起決于入侵病毒的數(shù)量、病毒強度及機(jī)體的免疫狀況。當(dāng)機(jī)體抗病能力強時，病毒即被消滅，臨床上也不表現(xiàn)癥狀，成為隱形的病毒攜帶者。當(dāng)機(jī)體的抵抗力低時，病毒可能隨血液散布到肝臟、脾臟等組織細(xì)胞中繼續(xù)繁殖，如果被感染者是抵抗力很低的幼兒、老人等，病毒就可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織內(nèi)增殖，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變。病毒進(jìn)入腦內(nèi)，增殖達(dá)到一定數(shù)量時造成腦損傷，表現(xiàn)出病癥。

乙型腦炎的主要預(yù)防措施是防蚊、滅蚊和免疫接種。滅蚊是防治乙型腦炎的重要措施，滅蚊的方法主要是藥物法、生物法和生態(tài)學(xué)方法，但是徹底滅蚊是不現(xiàn)實的，免疫接種是預(yù)防乙型腦炎的最重要最有效的措施。豬是乙型腦炎傳播過程中的重要宿主，乙腦病毒的感染呈現(xiàn)豬→蚊→人的鏈狀結(jié)構(gòu)。我國自1968年對人使用乙腦疫苗接種，明顯地控制了乙型腦炎的流行。目前應(yīng)用最為廣泛的是鼠腦滅活疫苗，原代地鼠腎滅活疫苗和原代地鼠腎減毒活疫苗。

4.2 診斷方法

4.2.1 臨床診斷

乙型腦炎有嚴(yán)格的季節(jié)性，發(fā)生呈散在性，有明顯的腦炎癥狀，懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、過臨產(chǎn)期不生，公豬發(fā)生睪丸炎。死后取大腦皮質(zhì)、丘腦和海馬角進(jìn)行組織學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)非化膿性腦炎等，可作為診斷的依據(jù)。肉眼病變主要在腦、脊髓、睪丸和子宮。腦膜和腦質(zhì)充血、出血、水腫。腫脹的睪丸實質(zhì)充血、出血和壞死灶。流產(chǎn)胎兒常見腦水腫、腹水增多，皮下有血樣浸潤，胎兒大小不等，有的呈木乃伊化[31－32]。

4.2.2 病原學(xué)診斷

病毒的分離鑒定是診斷乙腦病毒感染最直接、最傳統(tǒng)的病原學(xué)方法。從發(fā)病初期的患者血液、尸體腦組織均可分離到乙腦病毒。分離病毒可用BHK－21、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）等。病毒分離還可以采用乳鼠腦內(nèi)接種的方法，但敏感性低于細(xì)胞分離。在本病流行初期，采取發(fā)熱期血液，立即進(jìn)行雞胚卵形黃囊接種或1～5日齡乳鼠腦內(nèi)接種，可分離到病毒，但分離率不高。分離到病毒后可以采用反向被動血凝試驗、免疫細(xì)胞化學(xué)法、熒光抗體染色法、膠體金免疫層析試紙條法、RT－PCR技術(shù)、Real－Time PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)等方法對其進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)[33－34]。

4.2.3 血清學(xué)診斷方法

血清或腦脊液中乙型腦炎特異性抗體檢測是最常用和有效的診斷方法。特異性抗體的檢測方法包括血凝抑制試驗、補體結(jié)合試驗、中和試驗、乳膠凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗等。

[1]Yun S I,Kim SY,ChoiW Y,etal.Molecular characterization of the full－length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39[J].VirusRes,2003,96（1－2）:129－140.

[2]Prasad SR,Kumar V,Marwaha R K,et al.An epidemic of encephalitis in Haryana:serologicalevidence of Japanese encephalitis in a few patients[J].Indian Pediatr,1993,30（7）:905－910.

[3]Dhanda V,Thenmozhi V,Kumar N P,et al.Virus isolation from wild－caughtmosquitoes during a Japanses encephalitis outbreak in Kerala in 1996[J].Indian JM Res,1997,106:4－6.

[4]Schuh A J,Li L,Tesh R B,etal.Genetic characterization of early isolates of Japanese encephalitis virus:genotypeⅡhas been circulating sinceat least1951[J].JGen Virol,2010,91（1）:95－102.

[5]David TW,Wang L F,PeterW.Molecular characterization of the first Australian isolate of Japanese encephalitis virus,the FU strain[J].JGen Virol,2000,81:2 471－2 480.

[6]余永新,武佩芬,敖堅,等.一株免疫性進(jìn)一步提高的乙腦活疫苗減毒株的選育SA14－14－2弱毒株某些生物學(xué)特性[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,1981（1）:77－84.

[7]Nabeshima T,Loan H TK,Inoue S,etal.Evidence of frequent introductions of Japanese encephalitis virus from south－east Asia and continental east Asia to Japan[J].JGen Virol,2009,90（4）:827－832.

[8]張永欣,符芳,宋淑萍,等.中國東北地區(qū)3株日本腦炎病毒株的分離鑒定及基因分型[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,40（6）:73－78.

[9]王環(huán)宇,梁國棟.我國蟲媒病毒研究10年回顧[J].中國公共衛(wèi)生,2003（19）:473－476.

[10]Kolaskar A S,Kulkarni－Kale U.Prediction of three－dimensional structure andmapping of conformationalepitopes ofenvelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus[J].Virology,1999,261（1）:31－42.

[11]Mason PW,Dalrymple JM,Gentry M K,etal.Molecular characterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus structural glycoprotein[J].JGen Virol,1989,70（8）:2 037－2 049.

[12]Wu SC,LianW C,Hsu LC,etal.Japaneseencephalitis virusantigenic variantswith characteristic differences in neutralization resistance and mouse virulence[J].Virus Res,1997,51（2）:173－181.

[13]Wu S C,Lin C W.Neutralizing peptide ligands selected from phage－displayed libraries mimic the conformational epitope on domainⅢof the Japanese encephalitis virus envelope protein[J].Virus Res,2001,76（1）:59－69.

[14]KonishiE,Yamaoka M,Win K S,etal.The anamnestic neutralizing antibody response is critical for protection ofmice from challenge following vaccination with a plasmid encoding the Japanese encephalitis virus premembrane and envelope genes[J].J Virol,1999,73（7）:5 527－5 534.

[15]曾明,俞永新,董關(guān)木,等.乙型腦炎病毒減毒活疫苗株SA14－14－2基因組全序列的測定[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2001,21（5）:535－539.

[16]Lobigs M,Usha R,Nestorowicz A,et al.Host cell selection of Murray Valley encephalitis virus variants altered at an RGD sequence in the envelope protein and inmouse virulence[J].Virology,1990,176（2）:587－595.

[17]Chen W R,Tesh R B,Rico－Hesse R.Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature[J].JGen Virol,1990,71（12）:2 915－2 922.

[18]ChenW R,Rico－Hesse R,Tesh R B.A new genotype of Japanese encephalitis virus from Indonesia[J].Am JTrop Med Hyg,1992,47:61－69.

[19]Holbrook M R,Barrett A D T.Molecular epidemiology of Japanese encephalitis virus[J].Curr Top Microbiol Immunol,2002,267:75－90.

[20]Ma SP,Yoshida Y,Makino,Y,etal.Short report:amajor genotype of Japanese encephalitis virus currently circulating in Japan[J].Am JTrop Med Hyg,2003,69:151－154.

[21]Mackenzie JS,Chua K B,Daniels PW,et al.Emerging viral diseases of Southeast Asia and theWestern Pacific[J].Emerg Infect Dis,2001,7（3）:497－504.

[22]Phan TN,Maria del CP,Vuong D C,etal.Shift in Japanese encephalitis virus（JEV）genotype circulating in northern Vietnam:implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to EastAsia[J].JGen Virol,2004,85:1 625－1 631.

[23]Yang D K,Kim BH,Kweon CH,etal.Molecular characterization of full－length genome of Japanese encephalitis virus（KV1899）isolated from pigs in Korea[J].JVetSci,2004,5（3）:197－205.

[24]李曉宇,宋宏,付士紅,等.中國流行性乙型腦炎病毒的分子生物學(xué)特性研究[J].病毒學(xué)報,2004（20）:200－209.

[25]王環(huán)宇,付士紅,梁國棟,等.我國首次分離到基因Ⅰ型乙型腦炎病毒[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2004,24（11）:843－849.

[26]王俊文,付士紅,梁國棟,等.遼寧省乙腦病毒的分離與鑒定[J].中華實驗和臨床病毒學(xué),2006,20（3）:60－65.

[27]王作,安淑一,郭軍巧,等.遼寧省乙型腦炎病毒分離及進(jìn)化樹分析[J].中國公共衛(wèi)生雜志,2008,3（24）:341－343.

[28]SapkalGN,WairagkarNS,AyachitVM,etal.Detection and isolation of Japanese encephalitis virus from blood clots collected during the acute phase of infection[J].Am JTrop Med Hyg,2007,77（6）:1 139－1 145.

[29]SaitoM,Taira K,Itokazu K,etal.Recentchangeof theantigenicity and genotype of Japanese encephalitis viruses distributed on Okinawa Island Japan[J].Am JTrop Med Hyg,2007,77（4）:737－746.

[30]Wang H Y,Takasaki T,Fu SH,etal.Molecular epidemiological analysis of Japanese encephalitis virus in China[J].JGen Virol,2007,88（3）:885－894.

[31]胡仲達(dá).豬乙型腦炎的診斷與防治[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2010（1）:329－330.

[32]喬憲鳳.豬日本腦炎的診斷[J].豬業(yè)科學(xué),2008（6）:24－26.

[33]張丹,金擴(kuò)世,金寧一,等.乙型腦炎病毒分子生物學(xué)特性及檢測方法研究進(jìn)展[J].中國動物檢疫,2009,26（12）:70－72.

[34]Johnson BW,Kosoy O,Hunsperger E,etal.Evaluation of chimeric Japanese encephalitisand dengue viruses for use in diagnostic plaque reduction neutralization tests[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16（7）:1 052－1 059.