張在云，李希德，劉 葉，王志侖，潘祥林

(1山東大學第二醫(yī)院，濟南250033;2高密縣中醫(yī)院)

生物免疫治療是腫瘤治療的重要手段，胞外體(exosome)是多種細胞分泌到細胞外的小囊泡，具有抗原呈遞和誘導抗腫瘤免疫作用［1］。近年來exosome腫瘤疫苗受到廣泛關注，成為目前腫瘤免疫治療研究的熱點。樹突狀細胞(DC)是目前所知功能最強的抗原呈遞細胞，DC來源的exosome含有抗原呈遞分子及豐富的共刺激分子，與腫瘤抗原結合能激發(fā)抗腫瘤作用［2］。腫瘤細胞裂解物含豐富的細胞成分，用細胞裂解物刺激能否增強exosome誘導的抗腫瘤作用尚不清楚。2009年10月～2010年10月，我們觀察了肺癌細胞裂解物負載對DC分泌的exosome抗腫瘤作用的影響，旨在為制備高效的exosome腫瘤疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);GM-CSF(先靈葆雅公司);IL-4(R＆D 公司);TNF-α(R＆D 公司);CD1a、CD80及 CD83抗體(Immunotech公司);MTT(Sigma公司);超濾離心管(Millipore公司);鼠抗人 HSP70、HLA、CEA 抗體、兔抗鼠 IgG、ECL(Santa Cruz公司);A549肺癌細胞株為本實驗室保存。流式細胞儀(Beckman-coulter公司);超聲波細胞粉碎儀(寧波新科公司);超速冷凍離心機(日立公司);透射電鏡(Philips公司);酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2 肺癌細胞裂解物負載DC的制備及鑒定 分離外周血單個核細胞，貼壁培養(yǎng)2 h，用尼龍毛自非貼壁細胞分離T細胞，備用。貼壁細胞用含GMCSF(1 000 U/ml)及IL-4(500 U/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，第5天起加用TNF-α100 U/ml。倒置顯微鏡下見細胞表面出現(xiàn)突起及毛刺，表現(xiàn)為典型DC形態(tài)。第10天收集DC，調整細胞數(shù)為每管1×106個，加入CD1a、CD80及CD83抗體，流式細胞儀檢測細胞表面標志分子 CD1a、CD80及 CD83表達均升高，證實為典型DC。將A549細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%胰酶消化收集，調整細胞濃度為5×106/ml，置液氮10 min，37℃水浴溶解，反復凍融3次，用超聲波細胞粉碎儀裂解細胞(160 W，持續(xù)3 s，間隔5 s，共3 次)，10 000 ×g離心 10 min，取上清，用 0.22 μm微孔濾膜過濾，-20℃保存?zhèn)溆?。收集培養(yǎng)第5天DC，將細胞裂解物加入DC，并加TNF-α100 U/ml，培養(yǎng)72 h即得肺癌細胞裂解物負載DC。

1.3 肺癌細胞裂解物負載DC的exosome提取及鑒定 取肺癌細胞裂解物負載DC的上清液，用差速離心法提取exosome。細胞培養(yǎng)上清液1 000×g離心10 min;取上清，10 000×g離心10 min;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100 000×g離心1 h;取混有exosome的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到100 kD超濾離心管過濾，用0.22μm的濾膜過濾除菌。透射電鏡下觀察exosome形態(tài)，呈圓球形，囊泡狀，大小不一，直徑在30～100 nm，即為典型 exosome形態(tài)［3］。將 exosome沖擊破膜，取20μg用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白電轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，加入鼠抗人HSP70、HLA及CEA抗體，再加入兔抗鼠IgG抗體，ECL反應顯影結果示HSP70、HLA及CEA均呈陽性表達。

1.4 T細胞活化及殺傷率測定 將肺癌細胞裂解物負載DC的exosome(負載組)及未負載DC的exosome(未負載組)各10μg分別加入T細胞混合培養(yǎng)72 h，制成exosome刺激活化的T細胞。將肺癌細胞裂解物負載DC(DC組)與T細胞按1∶10混合培養(yǎng)72 h，制成DC活化的T細胞。以活化T細胞為效應細胞(E)，A549肺癌細胞為靶細胞(T)，按E/T為25∶1、10∶1、5∶1 比例混合培養(yǎng) 96 h，加入 MTT(5 mg/ml)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測波長490 nm的吸光度(A)值。重復實驗3次。計算殺傷率。殺傷率(%)=［靶細胞A值-(反應孔A值-T細胞A值)］/靶細胞A值×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較行χ2檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 exosome相關蛋白表達 蛋白檢測顯示肺癌細胞裂解物負載 DC來源的exosome有HSP70、HLA及CEA表達，而來源于未負載DC的exosome有HSP70及HLA表達，但無CEA表達。

2.2 殺傷率 E/T 為25∶1、10∶1、5∶1 時各組殺傷率均呈降低趨勢，負載組殺傷率分別為65.11% ±6.84%、43.21% ±4.89%、23.19 ±3.25%，未負載組分別為 30.50% ±4.11%、20.33% ±4.16%、10.34%±3.07%，DC 組分別為 50.25% ±4.43%、30.31% ±4.57%、17.34% ±3.20%，相同 E/T 值時負載組殺傷率均明顯高于未負載組(P均＜0.05);E/T為25∶1、10∶1時負載組殺傷率明顯高于DC組，P均＜0.05。

3 討論

exosome最早由Trams于正常細胞和腫瘤細胞培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)，后來在研究網(wǎng)織紅細胞成熟為紅細胞階段發(fā)現(xiàn)其釋放同樣的小囊泡狀結構，并命名為exosome。研究顯示，exosome可由B淋巴細胞、DC、肥大細胞、腸上皮細胞、腫瘤細胞及血小板等分泌［4，5］，組成復雜，含有與來源細胞功能相關的蛋白質或脂質等成分，由于不同細胞來源的exosome成分不同，因而其功能各異。exosome作為一種新的非細胞性腫瘤疫苗，避免了傳統(tǒng)細胞性瘤苗的不足，可高效呈遞抗原。其組成明確，穩(wěn)定性高，能夠在-80℃中保存至少2 a，應用于人體不良反應小。

DC為功能強大的專職性抗原呈遞細胞，是機體抗腫瘤免疫反應的啟動者和參與者，將DC的抗原呈遞功能與腫瘤抗原結合是活化T細胞的關鍵。用腫瘤特異性抗原、腫瘤非特異性抗原、腫瘤抗原肽、腫瘤細胞RNA及腫瘤細胞裂解物沖擊DC活化T細胞顯示了不同程度的抗腫瘤作用，其中腫瘤細胞裂解物負載誘導的抗腫瘤效力更強［6，7］。DC分泌的exosome含有豐富的抗原呈遞分子(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、四穿膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、黏附分子(CD11b、CD54)和共刺激分子CD86等免疫分子，可通過暴露MHC分子及共刺激分子直接調節(jié)免疫反應，亦可通過轉運內體成分到鄰近細胞而間接調節(jié)免疫反應［8］。但由于DC來源的exosome缺乏腫瘤抗原，因而不能有效活化T細胞。經(jīng)腫瘤抗原負載DC分泌的exosome含腫瘤抗原和抗原呈遞所需物質，可以呈遞抗原，直接刺激活化T細胞，誘導抗腫瘤免疫，其作用機制為:DC質膜表面的MHC分子結合抗原后通過內吞形成多囊體，然后向胞外釋放exosome，這些exosome攜帶了結合抗原的MHC復合物，能被效應細胞捕獲或定向于效應細胞，然后與效應細胞的質膜融合而將抗原提呈給效應細胞，同時exosome上存在的共刺激分子(CD80、CD86)將淋巴細胞活化，發(fā)揮特異性抗腫瘤作用［9］。

本研究用腫瘤細胞裂解物負載DC提取exosome顯示有CEA表達，表明exosome含有腫瘤抗原。用exosome刺激活化的T細胞對A549肺癌細胞有明顯殺傷作用，負載組殺傷率明顯高于DC組和未負載組，表明經(jīng)肺癌細胞裂解物負載DC的exosome能有效誘導抗腫瘤作用。用腫瘤細胞裂解物負載DC制備exosome疫苗，方法簡單方便，效力強，具有良好的應用前景。

［1］McLellan AD.Exosome release by primary B cells［J］.Crit Rev Immunol，2009，29(3):203-217.

［2］Viaud S，Théry C，Ploix S，et al.Dendritic cell-derived exosomes for cancer immunotherapy:what＇s next［J］.Cancer Res，2010，70(4):1281-1285.

［3］Clayton A，Mitchell JP，Court J，et al.Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2［J］.Cancer Res，2007，67(15):7458-7466.

［4］張家模，吳小候，張堯，等.膀胱移行細胞癌來源exosome的制備及相關蛋白分子的鑒定［J］.腫瘤防治研究，2010，37(6):636-639.

［5］Tan A，De La Pe?na H，Seifalian AM.The application of exosomes as a nanoscale cancer vaccine［J］.Int JNanomedicine，2010，(5):889-900.

［6］傅永強，張在云，柳月安，等.肺癌細胞負載樹突狀細胞疫苗的體內外抗腫瘤作用［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(6):562-564.

［7］Gilboa E.DC-based cancer vaccines［J］.JClin Invest，2007，117(5):1195-1203.

［8］朱偉國，朱建華.樹突狀細胞來源的exosome研究進展［J］.國際免疫學雜志，2009，32(1):27-31.

［9］Hao S，Bai O，Li F，et al.Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumour immunity［J］.Immunology，2007，120(1):90-102.