細胞高密度培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究進展

齊士朋，徐爾尼，羅玉芬，巫小丹

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌，330047)

細胞高密度培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用研究進展

齊士朋，徐爾尼，羅玉芬，巫小丹

(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌，330047)

細 胞高密度培養(yǎng)是指在人工條件下模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使細胞在生物反應(yīng)器中高密度生長，從而獲得大量的細胞及其代謝產(chǎn)物。該技術(shù)可以減少設(shè)備投入，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率，可極大地滿足市場的需求。文中就國內(nèi)外對該技術(shù)的應(yīng)用研究及其主要的培養(yǎng)方式的研究狀況進行了綜述。

細 胞高密度培養(yǎng)，代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)方式

細胞高密度培養(yǎng)(high cell density culture，HCDC)是指在人工條件下模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使細胞在細胞生物反應(yīng)器中高密度生長，使液體培養(yǎng)中的細胞密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上，最終達到提高特定代謝產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)的目的，用于發(fā)酵生產(chǎn)生物制品的技術(shù)。

細胞高密度培養(yǎng)不僅能夠提高單位體積培養(yǎng)液中菌體及或者是其代謝產(chǎn)物的濃度，強化下游分離提純，減少廢水量，而且能相應(yīng)縮小生物反應(yīng)器體積，縮短生產(chǎn)周期，減少生產(chǎn)

1 細胞高密度培養(yǎng)的應(yīng)用研究

發(fā)酵是通過微生物、動物和植物細胞的培養(yǎng)獲得所需的細胞或者是細胞的代謝產(chǎn)物，但是傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方式所得發(fā)酵液中最終的細胞濃度都不高，目前最高細胞濃度僅能達到10～20 g DCW/L，因此細胞代謝產(chǎn)物濃度的提高也受到了極大限制。隨著發(fā)酵劑的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的迅速增加，工業(yè)發(fā)酵的基本目標轉(zhuǎn)向了以最小的代價獲得最大產(chǎn)值和利潤［1］。因此人們開始研究細胞高密度培養(yǎng)技術(shù)，細胞高密度培養(yǎng)最早應(yīng)用于生產(chǎn)單細胞、乙醇［2］。

隨著技術(shù)的發(fā)展，細胞高密度培養(yǎng)已經(jīng)應(yīng)用到很多的方面，并且取得了一定的進展。

1.1 HCDC在乳制品生產(chǎn)方面的研究

由于人們對乳制品的需求大量增加，促使生產(chǎn)商尋求乳酸菌的最佳生產(chǎn)方式，獲得更高的生產(chǎn)率。

王奎明等［3］對保加利亞乳桿菌(Lac.delbrueckii subsp.bulgaricus)的高密度培養(yǎng)進行了初步研究，通過對合適的基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)條件，并以流加堿中和的方法控制培養(yǎng)基pH，使保加利亞乳桿菌的濃度達到1.0×1012CFU/mL，比傳統(tǒng)方式培養(yǎng)提高了10倍以上，實現(xiàn)了保加利亞乳桿菌的高密度培養(yǎng)。

李妍等［4］在優(yōu)化增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上確定 L.casei Zhang較適宜的高密度培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為80～100 g/L，以氨水為中和劑使pH保持5.9，采用間歇通氮氣的方法保持環(huán)境厭氧，在分批培養(yǎng)方式下，37℃保溫發(fā)酵10～12 h后，L.casei Zhang細胞干重達到7 g/L，活菌數(shù)為3.5×1010CUF/mL，比優(yōu)化前提高7倍以上，能夠滿足益生菌制品生產(chǎn)要求的高菌體密度。

鄧鵬超等［5］針對嗜酸乳桿菌(Lac.acidophilus)所需的營養(yǎng)物質(zhì)，采用正交分析的實驗方法優(yōu)化了嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)基配方，另外通過全自動發(fā)酵罐培養(yǎng)，確定了最優(yōu)的培養(yǎng)溫度為42℃，最優(yōu)的恒定培養(yǎng)pH為5.5，在此條件下培養(yǎng)9 h后添加補料，可以使菌數(shù)在15 h達到8.82×109CFU/mL，比優(yōu)化前(培養(yǎng)16 h，獲得的菌數(shù)為3.16×108CFU/mL)提高了20多倍。

1.2 HCDC在酵母工業(yè)中的研究

由于酵母已廣泛地應(yīng)用食品工業(yè)的發(fā)酵劑和飲料生產(chǎn)，實現(xiàn)高密度、高產(chǎn)率和高濃度培養(yǎng)是近幾年酵母發(fā)酵工業(yè)的目標和方向［6］。

段學(xué)輝等［7］比較了分批培養(yǎng)、分批補料及連續(xù)流加培養(yǎng)對酒精酵母細胞生長的影響。結(jié)果分批補料流加或連續(xù)流加有利于酒精酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的快速生長和得到較高的細胞濃度，分批補料流加或連續(xù)流加培養(yǎng)44 h，發(fā)酵液中酒精酵母細胞濃度分別達到71.82 g DCW/L和82.01 g DCW/L，比分批培養(yǎng)分別提高了155.68%和191.95%。而且，酵母的有效重復(fù)利用次數(shù)達4批次。

王穎等［8］考察了培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)發(fā)酵的影響。以TB培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基，通過正交實驗設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基組成，確定了最適培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件。采用優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下進行發(fā)酵，菌液最高OD600值和細胞密度分別達14.81和2.03×108個/mL，比優(yōu)化前分別提高24.2%和22.0%。

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，在表達異源蛋白方面具有諸多優(yōu)點。畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)物的累積不會對自身產(chǎn)生毒副作用，而且畢赤酵母的表達菌株很容易從搖瓶培養(yǎng)擴大到大批量高密度發(fā)酵，但不影響外源基因的表達水平。這兩點注定了畢赤酵母具有可用于高密度發(fā)酵的巨大潛力［9］。

余雪冰等［10］研究了畢赤酵母(Pichia pastoris)植酸酶工程菌高密度培養(yǎng)，對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基:甘油4%、蛋白陳2%、酵母粉0.5%、(NH4)2SO40.8%、K2HPO40.1%、KH2PO40.6%。最適溫度28℃，最適pH 6.0，最適接種量5×107個/mL。最終畢赤酵母菌體干重可達25.3 g/L，比優(yōu)化前提高了5倍左右。

1.3 HCDC在工程菌方面的研究

隨著生物技術(shù)在醫(yī)藥工業(yè)中的快速發(fā)展，越來越多的基因工程產(chǎn)品問世，人們在重視菌種的構(gòu)建和純化的同時，也越來越重視發(fā)酵工藝的改進。實現(xiàn)高密度培養(yǎng)是工程菌能否以盡可能低的成本實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素之一。

陳祥仁等［13］采用新型合成培養(yǎng)基SIH培養(yǎng)重組盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)，并通過逐步提高轉(zhuǎn)速和通氣量，保持發(fā)酵液中溶氧量在20%以上，在7L發(fā)酵罐中重組菌AX2-pAC6-D150的最大細胞密度達到4×107個/mL以上，從而為用這一新型真核表達系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)重組異源蛋白奠定了基礎(chǔ)。

李民等［14］研究了基因工程菌 E.coli BL21/pGEM-PEP表達重組的點狀產(chǎn)氣單胞菌脯氨酰內(nèi)肽酶(PEP)，他們選用了LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)化了發(fā)酵條件:轉(zhuǎn)速250 r/min，培養(yǎng)溫度為32℃，pH為7.0。利用5 L自控發(fā)酵罐經(jīng)20 h培養(yǎng)，最終菌體密度達OD60060(相當于干菌體22.5 g/L)，PEP表達量為28%，每升發(fā)酵液中含PEP酶3.15g，最終實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)的目的。

張雯英等［15］在小型填充床反應(yīng)器中培養(yǎng)表達rt-PA的CHO工程細胞時，在裝有5g載體的50 mL的小型填充床中培養(yǎng)，最高細胞數(shù)可達3.8×109個細胞，最高rt-PA濃度可達12mg/L，與小方瓶培養(yǎng)相比，含5g微載體填充床的小型生物反應(yīng)器每天rt-PA產(chǎn)率與1520個25 cm2的小方瓶相當。

胡沛臻等［16］建立人黑色素瘤抗原 MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重組工程菌E.coli BL21/pET-MHM的高密度發(fā)酵工藝。以搖瓶發(fā)酵結(jié)果為基礎(chǔ)，擴大至NBS BiofloⅣ20L發(fā)酵罐發(fā)酵，利用溶氧反饋-補料分批培養(yǎng)技術(shù)，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，采用半合成培養(yǎng)基，誘導(dǎo)起始時間控制在5 h左右，IPTG誘導(dǎo)濃度為200 μmol/L，pH值在7.0左右，限制性流加甘油，始終保持培養(yǎng)液中較低的碳源濃度(5～10 g/L)。連續(xù)3批重復(fù)發(fā)酵，最終菌密度OD600均達45～50，菌體量可提高至70 g/L以上，目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的38%以上。

1.4 HCDC在其他方面的研究

除了以上方面，高密度培養(yǎng)技術(shù)還應(yīng)用到其他的方面，如保健食品螺旋藻［17］。王長海等［18］利用自制的光生物反應(yīng)器對螺旋藻的生長進行了研究。結(jié)果表明:光照強度和液體循環(huán)速度對藻體細胞的生長有極顯著的影響，培養(yǎng)溫度對生長有顯著的影響。通過流加NaHCO3+CO2作為碳源，在4.9 mW/cm2、0.30 m/s的液體循環(huán)速度、33℃的溫度下進行培養(yǎng)，使藻細胞的生長速率、生物量產(chǎn)率和生物量產(chǎn)量分別達到了0.411/d、32.25 g/(m2·d)和3.93 g/L 的水平，最大生長速率達到了0.566/d。

利用高密度培養(yǎng)技術(shù)在環(huán)保方面的研究也是一個新的課題。耿金菊等［19］利用微生物的混合培養(yǎng)技術(shù)，研究了好氧條件下同時進行硝化-反硝化的生物脫氮過程，探索了實現(xiàn)混合脫氮微生物菌群高密度培養(yǎng)的條件，并使菌體表現(xiàn)出較高的氨氮去除能力，比常規(guī)培養(yǎng)提高了40.7%。

隨著飼用微生物市場需求的日益擴大，將高密度培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于飼用微生物的生產(chǎn)，可以改進發(fā)酵工藝，提高生產(chǎn)率，加速飼用微生物制劑的商品化進程，更好地滿足市場需求，具有重要而深遠的意義。

2 細胞高密度培養(yǎng)方式的研究

細胞高密度培養(yǎng)的方式主要有下列幾種:補料分批培養(yǎng)、細胞循環(huán)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)和細胞固定化包埋培養(yǎng)技術(shù)等。

2.1 補料分批培養(yǎng)

Yohsdia等人［20］首次提出了“fed-batch culture”，這個術(shù)語，并從理論上建立了第一個數(shù)學(xué)模型，補料分批培養(yǎng)的研究才開始進入理論研究階段。補料分批培養(yǎng)的關(guān)鍵問題是最優(yōu)化問題，即找出最佳的補料流加方式和最佳的培養(yǎng)條件，以維持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)。

潘麗軍等［21］采用分批補料方式對米根霉3.819(Rhizopus oryzae 3.819)高密度培養(yǎng)產(chǎn)L-乳酸進行研究。通過葡萄糖濃度反饋流加的方式進行培養(yǎng)，葡萄糖初始濃度160 g/L，分批培養(yǎng)24 h后開始流加補料，補料液中葡萄糖與硫酸銨的質(zhì)量比為20∶1。最終獲得了較高的菌體密度，菌體干重達18.45 g/L;重復(fù)發(fā)酵5批次，產(chǎn)L-乳酸效率達2.25 g/(L·h);菌體干重和產(chǎn)酸效率較分批培養(yǎng)分別提高了92.9%和82.9%。

靳志強等［22］采用補料分批發(fā)酵和化學(xué)中和的相結(jié)合的方法，對保加利亞亞種乳桿菌S-1(Lactobacillus delbeueckii subsp.bulgaricus S-1)進行高密度培養(yǎng)的研究。在5L自控發(fā)酵罐中進行批次補糖實驗，采用恒速流加、葡萄糖反饋流加和指數(shù)流加3種不同的補糖方式，結(jié)果證明，葡萄糖反饋流加的方式可獲得較高的菌體密度，菌體干重達到3.889 g/L，較分批培養(yǎng)提高了43.8%。

劉馨磊等［23］在5L自動發(fā)酵罐中進行補料分批培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌TQ33(Bacillus coagulans TQ33)，確定了補料液中的葡萄糖與酵母膏比例，在12～26h的培養(yǎng)期間，將葡萄糖濃度控制在3.0～6.0 g/L的流加方式進行培養(yǎng)，最終菌體濃度達到4.5×109CFU/mL，芽孢濃度為1.2×109CFU/mL，分別是分批培養(yǎng)的5.9倍和3.8倍。

Lim等［24］在培養(yǎng)重組大腸桿菌(Escherichia coli)生產(chǎn)干擾素-a時，采用了DO-stat補料策略。分批階段，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和在通風口混入純氧，維持溶氧在20%以上，補料階段，通過調(diào)節(jié)補料維持溶氧在50%左右。最終所獲得的細胞量為OD600160，最高細胞濃度提高了3倍左右。

Babu等［25］在用重組大腸桿菌TGI生產(chǎn)干擾素-a時，以葡萄糖作為唯一的碳源和能源，采用指數(shù)補料策略，誘導(dǎo)階段的細胞量接近100 g DCW/L，最高細胞濃度提高了10倍左右。

2.2 細胞循環(huán)培養(yǎng)

細胞循環(huán)培養(yǎng)是通過沉降、離心、膜過濾等方式將細胞保留在培養(yǎng)罐中加以循環(huán)利用。細胞循環(huán)可以用低濃度的培養(yǎng)基得到高的細胞密度，可以除去抑制性代謝產(chǎn)物，有利于下游操作。隨著膜材料技術(shù)的不斷開發(fā)與完善，膜過濾得到廣泛的應(yīng)用。

Park等［26］采用柱形陶瓷管作為內(nèi)嵌式過濾膜，連續(xù)培養(yǎng)啤酒酵母(Saccharomyces cerecvisiae)生產(chǎn)乙醇，通過周期性地去除膜表面的污垢，其過濾性能可以成功地維持2個月。所取得的生產(chǎn)率達13 g/(L·h)，細胞濃度達50～58 g DCW/L，分別為傳統(tǒng)恒化培養(yǎng)(無膜細胞循環(huán))的3.3倍和5倍。

Chang等［27］采用內(nèi)嵌式不銹鋼濾器進行連續(xù)乙醇發(fā)酵時，最大酵母細胞濃度為157 g DCW/L。

Lee等［28］采用外置式膜細胞循環(huán)反應(yīng)器，對重組大腸桿菌(E.coli HB101)進行全細胞循環(huán)培養(yǎng)以生產(chǎn)青霉素?；D(zhuǎn)移酶。通過調(diào)節(jié)葡萄糖濃度，細胞密度達到145 g DCW/L。

Kang等［29］采用內(nèi)嵌陶瓷過濾系統(tǒng)對蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiesis)進行了細胞循環(huán)培養(yǎng)。當補料中葡萄糖濃度為50 g/L時，獲得的孢子濃度為1.6×1010CFU/mL，最大細胞量為82.2 g DCW/L，孢子含量高于95%，體積產(chǎn)率是分批培養(yǎng)的4倍。

2.3 透析培養(yǎng)

Osborne［30］1977年首次將透析用于乳酸桿菌(Lactobacillus)培養(yǎng)，獲得了1×1011CFU/mL的菌體密度，相當于30～40 g DCW/L。

透析培養(yǎng)是通過半透膜有效的去除有害的低分子代謝產(chǎn)物，并向培養(yǎng)液提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式。這種培養(yǎng)方式可以增加生物量的積累，降低營養(yǎng)物質(zhì)的損失。

透析培養(yǎng)有下列優(yōu)點:①透析培養(yǎng)可以增加生物量的積累，達到很高的細胞密度，約為其它發(fā)酵方法的30倍;②與微濾和超濾相比，在透析過程中透析膜不會被阻塞，并可長時間維持其滲透性能。

Markl等［31］以 Staphylococcus carnosus生產(chǎn)胞外脂酶，當向透析室連續(xù)不斷地通入高濃度底物時，46 h內(nèi)得到60 g DCW/L的細胞生物量和227 mg/L的脂酶，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式都有很大的提高。

Nakano等［32］在控制溶氧水平的前提下，以不同碳源透析培養(yǎng)大腸桿菌(E.coli)12 h，取得了極高的細胞密度。當用葡糖糖作碳源時，所得細胞量為190 g DCW/L;當用甘油作碳源時，所得細胞量為180 g DCW/L。

2.4 細胞固定化包埋培養(yǎng)

細胞固定化包埋培養(yǎng)技術(shù)是一種以應(yīng)用化學(xué)或物理手段，將細胞包埋在多孔載體內(nèi)部，可使細胞保持活性并可反復(fù)利用的細胞高密度培養(yǎng)技術(shù)。該技術(shù)大大提高了單位時間、單位容積的生產(chǎn)能力，使發(fā)酵產(chǎn)物易于與菌體分離，而且固定化細胞對雜菌的污染和代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用比游離細胞具有更高的抵抗力。

Givry等［33］利用海藻酸鈣固定化乳桿菌(Lactobacillus)，發(fā)酵半纖維素水解液生產(chǎn)乳酸，乳酸產(chǎn)量為62.77 g/L，而采用游離細胞發(fā)酵產(chǎn)量只有41.3 g/L。

賀銀鳳等［34］對乳酸菌(Lactobacillus bugaricus)固定化工藝參數(shù)及發(fā)酵特性進行了研究，結(jié)果表明，乳酸菌包埋法固定最佳工藝條件為:海藻酸鈉的濃度為2%，菌體的稀釋比例為1∶1，CaCl2溶液的濃度為1.5%，固定化溫度為42℃，固定化細胞膠珠含菌量為4.59×109個/g。

齊香君等［35］研究了在柱式反應(yīng)床中進行固定化乳酸菌(L.bugaricus)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，固定化細胞在柱式反應(yīng)床中可以連續(xù)發(fā)酵5批次無細胞泄漏，產(chǎn)酸穩(wěn)定，乳酸產(chǎn)量為69.28 g/L，未固定化細胞產(chǎn)酸量僅為37.6 g/L，明顯提高了乳酸菌的產(chǎn)酸量。

柳萍等［36］利用新方法進行固定化乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。確定固定乳酸菌的條件為海藻酸鈉濃度3.0%，CaCl2濃度為5%，細胞懸浮液體積∶海藻酸鈉溶液體積為1∶4。以海藻酸鈣為載體包埋固定干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。用離子交換樹脂從發(fā)酵液中分離出乳酸，分離出產(chǎn)物后的發(fā)酵液返回反應(yīng)器循環(huán)利用。與游離細胞發(fā)酵法相比，糖轉(zhuǎn)化率和乳酸生產(chǎn)速率分別由86.2%和0.328 g/(L·h)提高到94.7%和0.482 g/(L·h)。

3 展望

細胞高密度培養(yǎng)不僅是生產(chǎn)高質(zhì)量的濃縮型細胞和代謝產(chǎn)物的重要環(huán)節(jié)，是工程菌和非工程菌能否以低成本實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵性因素，也是細胞和代謝產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)過程中必需達到的重要目標與方向。

隨著市場需求的日益擴大，高密度培養(yǎng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于各種細胞(植物、動物、微生物)的生產(chǎn)中，它不僅可以改進發(fā)酵工藝，提升其現(xiàn)代化發(fā)酵進程，而且對于增加單位體積培養(yǎng)液中菌體數(shù)量，提高生產(chǎn)率，加速微生物制劑的商品化進程，更好地滿足市場需求，具有重要而深遠的意義。

但是目前細胞高密度培養(yǎng)仍然是我國生物制品難以攻下的課題，只有對細胞高密度培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)進行不斷的研究、改進，科學(xué)系統(tǒng)地運用，才能對我國傳統(tǒng)的生物制品生產(chǎn)技術(shù)進行升級和科技創(chuàng)新。

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Research Progress of Application in High Cell Density Culture

Qi Shi-peng，Xu Er-ni，Luo Yu-fen，Wu Xiao-dan
(State key Laboratory of Food Science and Technology，School of Life Science and Food Engineering，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

High cell density culture refers to the simulation of artificial environment of human body in bioreactor for high-density cell growth and the yield of great amount of cells and their metabolites.This technique can reduce the cost of the equipment，production，shorten the production cycle，and dramatically improve productivity to meet the market demand.This paper reviews the application research of this technique and the research condition of the key culture methods.

high cell density culture，metabolites，culture method

碩士研究生。

2010－05－31，改回日期:2010－11－16