程 鵬, 張愛(ài)兵

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

生命條形碼新秀:DNA微型條形碼技術(shù)

程 鵬, 張愛(ài)兵

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

近些年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)為便捷的物種鑒定提供了很大的幫助，但隨著該技術(shù)的發(fā)展，也出現(xiàn)了一系列的問(wèn)題。微型條形碼技術(shù)是作為DNA條形碼技術(shù)的補(bǔ)充而出現(xiàn)的一項(xiàng)新興技術(shù)，具體是指通過(guò)通用引物擴(kuò)增出比細(xì)胞色素c氧化酶I號(hào)基因全序列更短的一段序列，并通過(guò)該序列進(jìn)行物種鑒定、分類(lèi)等研究工作。作為一項(xiàng)新興技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)包括，適用于部分降解的DNA樣品的目的基因擴(kuò)增，能夠很好地解決環(huán)境混合樣品多樣性的調(diào)查等。但是，該技術(shù)所選DNA片段非常短，因此標(biāo)記序列包含的遺傳信息有限，在鑒定的精確度方面和COI全條形碼存在一定的差距。本文在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)要概述了微型條形碼技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并對(duì)其未來(lái)在害蟲(chóng)分子識(shí)別方面的應(yīng)用做了初步探討。

微型條形碼； 物種鑒定； DNA降解； 環(huán)境混合樣品

由于資金的限制及年輕分類(lèi)學(xué)家的匱乏，分類(lèi)學(xué)的發(fā)展在過(guò)去幾十年里受到了嚴(yán)峻的考驗(yàn)，曾一度有沉寂的趨勢(shì)(Mallet amp; Willmott，2003)，但近年來(lái)又呈現(xiàn)出勃勃生機(jī)。其中主要是因分子生物學(xué)技術(shù)和因特網(wǎng)的介入而提出的DNA分類(lèi)學(xué)和DNA條形碼(Hebertetal.,2002)。DNA條形碼是指一段特殊的DNA序列，既可以用于辨別物種，還可以用于研究近緣種之間的進(jìn)化關(guān)系(Hebertetal.,2003)。

在Hebert等人研究的基礎(chǔ)上，許多科學(xué)家接受了將細(xì)胞色素c氧化酶I號(hào)(COI)基因序列作為動(dòng)物DNA條碼的設(shè)想(Tautzetal.，2003)，這個(gè)序列也逐步成為了物種鑒定最常用的分子標(biāo)記之一。從此，生命條形碼工程便成為科學(xué)家們的一個(gè)宏偉計(jì)劃，即試圖建立一個(gè)基于標(biāo)準(zhǔn)的分子序列的物種鑒定系統(tǒng)(Frezal amp; Leblois，2008)。但是，隨著DNA條形碼技術(shù)研究的深入與推廣，人們發(fā)現(xiàn)其在實(shí)際工作中常常受到限制。如對(duì)待檢標(biāo)本要求高、在館藏標(biāo)本中的應(yīng)用難度大等。DNA微型條形碼的出現(xiàn)，在很大程度上彌補(bǔ)了以上傳統(tǒng)條形碼的缺點(diǎn)與不足，其在物種鑒定上的使用也越來(lái)越廣泛，并取得了一系列的成果(Milleretal.,2005;歐陽(yáng)小艷等，2007;Wardetal.,2009)。本文就該技術(shù)的研究成果及優(yōu)缺點(diǎn)做簡(jiǎn)要概述，并對(duì)其將來(lái)可能應(yīng)用的方向做初步的探討，以期為微型條形碼技術(shù)的完善及其對(duì)外來(lái)入侵害蟲(chóng)的防治方面提供參考。

1 DNA條形碼的定義及微型條形碼的研究成果

1.1 DNA條形碼的定義及其序列特征

DNA條形碼是指線(xiàn)粒體氧化酶C從5′端開(kāi)始的一段長(zhǎng)度約650 bp的DNA序列(Hebertetal.,2002)。能夠用于條形碼的基因必須具備2個(gè)看似矛盾的特征：(1)相對(duì)的保守性，便于用通用引物擴(kuò)增出來(lái)；(2)足夠的變異性,以便將物種區(qū)別開(kāi)來(lái)。綜合基因序列的長(zhǎng)度和進(jìn)化速率2個(gè)條件，最終選定COI序列,即一段約650個(gè)堿基長(zhǎng)度的片段作為條形編碼基因。這是因?yàn)椋?1)動(dòng)物生命中絕大部分階段都有COI基因序列；(2)大多數(shù)細(xì)胞中都有上百個(gè)線(xiàn)粒體，但只有一組染色體，因此等量的樣品中，線(xiàn)粒體的DNA更容易被放大和使用；(3)與細(xì)胞核的DNA相比，線(xiàn)粒體DNA的突變速度是核DNA的10倍，意味著核DNA能夠保留原來(lái)的變異而線(xiàn)粒體原來(lái)的變異會(huì)很快地丟失，使物種分離更準(zhǔn)確；(4)線(xiàn)粒體的遺傳方式屬于母性遺傳，COI基因位于細(xì)胞線(xiàn)粒體中，因此只能從母體中遺傳，這樣基因重組的發(fā)生率低；(5)它還擁有蛋白編碼基因所共有的特征，即密碼子第三位堿基不受自然選擇壓力的影響,可以自由變異；(6)COI基因在能夠保證足夠變異的同時(shí)又很容易被通用引物擴(kuò)增，其DNA序列本身很少存在插入和缺失(即使有少數(shù)也主要分布于該基因的3′端，對(duì)結(jié)果的分析不會(huì)造成很大的影響)。COI基因序列現(xiàn)已成為鑒定動(dòng)物的DNA條形碼。

1.2 DNA微型條形碼的研究成果

DNA微型條形碼開(kāi)始是針對(duì)博物館標(biāo)本提出的(Hajibabaeietal.,2006)，近年來(lái)，中外學(xué)者對(duì)此做了一系列的嘗試并取得了一定的成果。Hajibabaeietal.(2006)證明了可以從已經(jīng)發(fā)生DNA降解的館藏標(biāo)本中擴(kuò)增出134 bp的目的基因；同時(shí)通過(guò)對(duì)來(lái)自哥斯達(dá)黎加地區(qū)的寄生蜂進(jìn)行試驗(yàn)，驗(yàn)證了135 bp的COI序列可以很好地應(yīng)用于物種鑒定。盡管COI序列的內(nèi)部切割思想在當(dāng)時(shí)非常新穎并且對(duì)條形碼技術(shù)的發(fā)展起到了很大作用，但其工作是基于計(jì)算機(jī)模擬，并未考慮擴(kuò)增微型條形碼的引物設(shè)計(jì)問(wèn)題，缺乏實(shí)際證明。在此基礎(chǔ)上，Meusnieretal.(2008)通過(guò)對(duì)現(xiàn)有DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中的已測(cè)序列進(jìn)行計(jì)算得到，隨著被擴(kuò)增序列長(zhǎng)度的縮短，其引物的通用性增強(qiáng)，但縮短的序列鑒定物種的能力會(huì)有一定的減弱。當(dāng)COI序列長(zhǎng)度大于100 bp時(shí)即可鑒定90%以上的物種；擴(kuò)增130 bp的部分COI序列比擴(kuò)增650 bp的COI序列容易；同時(shí)，他們將這段130 bp的條形碼應(yīng)用于鱗翅目蛾類(lèi)館藏標(biāo)本的鑒定研究，結(jié)果證明了該條形碼在館藏標(biāo)本鑒定中的正確性。從此，DNA微型條形碼技術(shù)逐漸走向成熟。Dubeyetal.(2009)將復(fù)合引物PCR技術(shù)與微型條形碼技術(shù)結(jié)合起來(lái)，直接將PCR的產(chǎn)物電泳條帶(380、265、130 bp)用于印度瀕危蛇類(lèi)的鑒定。這在一定程度上利于新物種的發(fā)現(xiàn)，并且節(jié)約了大量成本。但是，PCR條帶始終無(wú)法直接反映DNA序列的內(nèi)部信息，因此還需要提升測(cè)序技術(shù)。范京安等(2009)也將微型條形碼技術(shù)用于海關(guān)檢驗(yàn)中果實(shí)蠅的物種鑒定。其以一種生物信息學(xué)模擬與試驗(yàn)相結(jié)合的方法，進(jìn)一步證明了微型條形碼可以用于物種鑒定，并且運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法從基因位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上對(duì)微型條形碼的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的理論支持。

1.3 DNA微型條形碼的基本操作過(guò)程

DNA微型條形碼的基本操作過(guò)程主要包括：(1)樣品的采集與處理；(2)基因組DNA的提取及電泳確認(rèn)；(3)利用COI全條形碼的傳統(tǒng)引物擴(kuò)增COI基因片段及電泳檢驗(yàn)；(4)當(dāng)步驟(3)確認(rèn)無(wú)法擴(kuò)增出完整的COI時(shí)，利用微型條形碼的通用新型引物擴(kuò)增部分COI基因片段及電泳確認(rèn)；(5)PCR產(chǎn)物的純化與克??；(6)測(cè)序和序列分析；(7)微型條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建以及在相關(guān)領(lǐng)域中的具體應(yīng)用。

2 傳統(tǒng)分類(lèi)方法、DNA條形碼技術(shù)與微型條形碼技術(shù)的比較

2.1 傳統(tǒng)分類(lèi)方法的貢獻(xiàn)與不足

盡管傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)為分類(lèi)學(xué)奠定了基礎(chǔ)、提供了框架和依據(jù)，但其鑒定手段復(fù)雜且效率不高，對(duì)工作人員的經(jīng)驗(yàn)和專(zhuān)業(yè)有相當(dāng)高的要求。常規(guī)形態(tài)學(xué)鑒定方法有4個(gè)方面的缺陷：(1)由于物種表型的可塑性和遺傳的可變性，容易導(dǎo)致不正確的鑒定；(2)無(wú)法鑒定許多群體中普遍存在的隱存分類(lèi)單元；(3)受生物性別和發(fā)育階段的限制，很多生物無(wú)法被鑒定；(4)雖然現(xiàn)代交互式鑒定系統(tǒng)是一個(gè)很大的進(jìn)步，但它要求很高的專(zhuān)業(yè)技術(shù)，一旦操作不正確則很容易導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果?！靶螒B(tài)學(xué)鑒定的局限性和不斷縮減的分類(lèi)學(xué)家隊(duì)伍，使分類(lèi)學(xué)的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)，亟需一種快捷方便的物種鑒定方法產(chǎn)生”(Hebertetal.,2003)。

2.2 DNA條形碼技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與不足

首先，DNA條形碼技術(shù)的運(yùn)用改善了分類(lèi)學(xué)多年不夠活躍給生物科學(xué)帶來(lái)的負(fù)面影響。如資源投入不足、合格的分類(lèi)工作者較少等(Gotelli,2004)。DNA條形碼技術(shù)既準(zhǔn)確、快捷，又降低了對(duì)工作者經(jīng)驗(yàn)的要求，使得一些難度較大或工作量較大的物種鑒定工作變得相對(duì)容易。其次，DNA條形碼對(duì)保護(hù)生物學(xué)、生物進(jìn)化歷史研究的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。它將完成一些傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定手段無(wú)法完成的工作，如鑒定生物的卵和幼體、動(dòng)物或植物的寄生物，以及解決形態(tài)學(xué)手段難以攻克的隱存種問(wèn)題，或者根據(jù)對(duì)動(dòng)物腸道包含物或排泄物的分析來(lái)解決食物鏈問(wèn)題。這個(gè)計(jì)劃本身的發(fā)展，要求一系列更快、更好、更廉價(jià)技術(shù)的支持，這勢(shì)必會(huì)推動(dòng)相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，從而讓其他相關(guān)的生物科學(xué)受益。此外，DNA條形碼技術(shù)也可以為入侵生物的預(yù)防和控制研究提供幫助(Armstrong amp; Ball,2005)。

同時(shí)，DNA條形碼技術(shù)也存在一些問(wèn)題。如DNA的易降解性大大制約了條形碼技術(shù)的適用范圍，而且該技術(shù)在館藏標(biāo)本以及福爾馬林浸泡的標(biāo)本上應(yīng)用也達(dá)不到預(yù)期的效果。對(duì)于線(xiàn)粒體變異速率的要求，即適度的變異速率也是對(duì)DNA條形碼的制約因素之一，如植物的線(xiàn)粒體具有極端的進(jìn)化保守性，即其DNA異質(zhì)化程度相當(dāng)?shù)?，所以，COI序列不能作為鑒定植物的條形碼序列。此外，由于不同的引物對(duì)片段的擴(kuò)增有偏向性(Bellemainetal.,2010)，DNA條形碼技術(shù)在新物種的確定以及環(huán)境混合樣品的分析中也存在一些問(wèn)題。如DNA條形碼技術(shù)一般要求完整的COI序列長(zhǎng)度為650 bp，這使得引物的通用性無(wú)法滿(mǎn)足不同物種的要求(Meusnieretal.,2008)。因此，在建立國(guó)際DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)程中，必須去攻克這些隨之而來(lái)的問(wèn)題，否則，DNA條形碼生命數(shù)據(jù)系統(tǒng)(BOLD)永遠(yuǎn)不可能成為一個(gè)普適性的系統(tǒng)(Frezal amp; Leblois,2008)。

2.3 微型條形碼技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與缺陷

隨著生命條形碼工程的不斷發(fā)展，一系列的問(wèn)題需要新的技術(shù)來(lái)完善和補(bǔ)充，從而使DNA條形碼能發(fā)展得更好。正如條形碼的倡導(dǎo)者Hebert所言“微型條形碼系統(tǒng)顯著地?cái)U(kuò)大了DNA條形碼技術(shù)的應(yīng)用范圍，我們已經(jīng)驗(yàn)證了可以從已經(jīng)降解的館藏標(biāo)本中擴(kuò)增出微型條形碼；另外，配合高通量測(cè)序技術(shù)，微型條形碼引物的通用性使得研究環(huán)境混合樣品成為了可能，一種廉價(jià)而全面的研究生物多樣性的方法成為了現(xiàn)實(shí)”(Meusnieretal., 2008)。因此，微型條形碼憑借其引物的通用性強(qiáng)、擴(kuò)增能力高，且較強(qiáng)的物種分類(lèi)能力，得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。如Dubeyetal.(2010)通過(guò)蛇殘片微型條碼的檢測(cè)，來(lái)防止一些非法商人對(duì)珍稀蛇類(lèi)的捕殺。

由于DNA微型條形碼技術(shù)現(xiàn)階段主要還是基于COI序列中的一段，許多COI全條形碼技術(shù)中的缺陷同樣存在于微型條形碼分類(lèi)技術(shù)中。第一，采樣不足在很多時(shí)候會(huì)造成條形碼庫(kù)出現(xiàn)鑒定盲區(qū)(Meyer amp; Paulay,2005),因此，在采樣過(guò)程中，應(yīng)盡可能采到絕大部分已經(jīng)確認(rèn)存在的種并保證其足夠的個(gè)體數(shù)量。這一點(diǎn)在實(shí)際工作中往往會(huì)成為建立DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的一個(gè)制約。第二，由于線(xiàn)粒體DNA的遺傳主要由母系決定，線(xiàn)粒體的母系遺傳成為分析COI序列過(guò)程中需要考慮的因素。已有研究證明，僅僅使用COI序列在一些時(shí)候不能正確地鑒定物種的種類(lèi)(Burnsetal.，2007)。因此，在微型條形碼技術(shù)的使用中，同樣要考慮這一點(diǎn)。第三,對(duì)于10倍閾值法則的爭(zhēng)議。在2007年Hebertetal.對(duì)北美地區(qū)260種鳥(niǎo)的COI基因進(jìn)行了研究(Kerretal.，2007)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其近源種間COI序列差異(7.0%～8.0%)約比種內(nèi)(0.3%～0.4%)大20倍。因此認(rèn)為，大多數(shù)北美地區(qū)的鳥(niǎo)類(lèi)物種均可用該序列進(jìn)行區(qū)分，并將10倍的種內(nèi)變異(約3.0%)作為標(biāo)記物種遺傳分化的“標(biāo)準(zhǔn)序列閾值”，低于此數(shù)值的物種之間即使存在生物學(xué)差異也被認(rèn)為是同種。許多科學(xué)家認(rèn)為，這個(gè)法則存在著很大的主觀(guān)性，并且許多情況與實(shí)際不一致(Meieretal.,2008)。第四，假基因在COI基因PCR過(guò)程中的出現(xiàn)也是一個(gè)值得考慮的問(wèn)題(Songetal.,2008)。由于微型條形碼引物的通用性高，在實(shí)際工作中應(yīng)尤為重視。第五，許多學(xué)者對(duì)單序列條形碼的信度問(wèn)題始終存在著爭(zhēng)議，因此，許多研究選擇采用多位點(diǎn)基因序列分析并結(jié)合其形態(tài)信息，記錄更多的生態(tài)信息，綜合這些信息和序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)進(jìn)行物種鑒定。此外，微型條形碼較短，包含的序列信息明顯低于全條形碼，因此，在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中，雖然鑒定物種的正確率符合預(yù)期要求，但與全條形鑒定物種的正確率相比，還有微小的差距(Meusnieretal.,2008)。

3 展望

微型條形碼技術(shù)雖然在發(fā)展中遇到一系列的問(wèn)題，但隨著研究的深入，該技術(shù)將得到不斷完善。國(guó)際生物條形編碼計(jì)劃倡導(dǎo)全球統(tǒng)一行動(dòng)，現(xiàn)在一個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室平均每年可得到1000個(gè)以上物種的目的片斷序列；并且隨著DNA測(cè)序技術(shù)的革新，配合微型條形碼技術(shù)，不僅使DNA鑒定的成本大大降低，而且在一定程度上解決了DNA降解問(wèn)題，條形碼數(shù)據(jù)為館藏標(biāo)本的使用提供了空間，提高了生命條形碼工程的可行性以及完成速度。生命條形碼工程作為最直接的信息資源，將成為全球生物鑒定系統(tǒng)(global bioidentification system, GBS)的基礎(chǔ)。若該數(shù)據(jù)庫(kù)被全球生物多樣性信息機(jī)構(gòu)(Global Biodiversity Information Facility)或生物物種基金(All Species Foundation)利用，網(wǎng)絡(luò)信息資源長(zhǎng)期缺乏的問(wèn)題將得到解決。Hebertetal.(2003)預(yù)計(jì)整個(gè)計(jì)劃的實(shí)施將花費(fèi)10億美元，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人類(lèi)基因組計(jì)劃和國(guó)際空間站的成本。在保護(hù)生物學(xué)方面，DNA微型條形碼技術(shù)將對(duì)生物多樣性研究的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用，主要體現(xiàn)在可以快速有效地完成環(huán)境混合樣品多樣性調(diào)研。在外來(lái)物種入侵防治方面，DNA微型條形碼技術(shù)為新種和隱存種的發(fā)現(xiàn)提供了必不可少的佐證(Hajibabaeietal.,2006)，因此，運(yùn)用該技術(shù)監(jiān)控一個(gè)區(qū)域是否發(fā)生外來(lái)物種入侵將成為可能。

總之，DNA微型條形碼技術(shù)作為一種與傳統(tǒng)DNA條形碼技術(shù)結(jié)合的新興技術(shù)，必將推動(dòng)分類(lèi)學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展。

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Notivebarcodeoflife：DNAmini-barcodetechnology

Peng CHENG, Ai-bing ZHANG

CollegeofLifeSciences,CapitalNormalUniversity,Beijing100048,China

In recent years, DNA barcode technology make great help in identification of species, but there are some problems with the development of the technology. Mini-barcode technology as a supplement to DNA barcoding has been proposed recently. This method amplifies a sequence which is much shorter than the cytochrome c oxidase subunit I sequence by universal primers to identify and classify species. As a new technology, its advantages include, such as amplifying the target gene for partly degenerated DNA samples, as well as a good solution to the diversity of environmental investigation in mixed samples and so on. However, the target gene of the new technology is a very short DNA fragment. Therefore, the genetic marker sequence contains limited information. So, there is a certain gap between the full barcode in the accuracy of identification. Here, based on previous studies, we make a brief summary of advantages and disadvantages of DNA mini-barcode and its potential applications, especially to identification of the invasive species.

mini-barcode; species identification; DNA degradation; environmental sample

2010-12-24接受日期2011-02-01

北京市自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201010028028)；國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(31071963)；北京市人才強(qiáng)教“創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”項(xiàng)目資助(PHR201107120)

張愛(ài)兵，E-mail: zhangab2008@mail.cnu.edu.cn