朱杰 郭連紅 張?jiān)娨?王霖 王國棟

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 理學(xué)院 生物物理研究所 心血管再生研究組，陜西 楊凌712100;2. 吉林大學(xué) 超分子結(jié)構(gòu)與材料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012;3. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100;4. 中南大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410078；5. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

前言

1986年，斯坦福大學(xué)的Binnig G等人發(fā)明的原子力顯微鏡 (Atomic Force Microscope, AFM)的放大倍數(shù)}遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過以往的任何顯微鏡[1]。光學(xué)顯微鏡(Optical Microscopy, OM)的放大極限僅為103倍，電子顯微鏡(Electronic Microscopy，SEM/TEM)的放大極限也只有106倍，而AFM的放大極限則高達(dá)109倍，在觀察生物大分子的結(jié)構(gòu)上具有很大的優(yōu)勢(shì)。另外，作為目前生物醫(yī)學(xué)超微結(jié)構(gòu)研究最常用的工具，SEM/TEM成像要求對(duì)生物樣品進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片、染色或鍍金等一系列繁瑣處理；而AFM 則可在大氣或溶液中直接觀測(cè)生物樣品及其動(dòng)態(tài)變化過程。除此以外，AFM通過控制并檢測(cè)針尖--樣品之間的相互作用力，可以分析研究與作用力相應(yīng)的各種表面性質(zhì)：采用最新的Tapping技術(shù)和Phase技術(shù)可以測(cè)試樣品的硬度和彈性等力學(xué)特性；AFM可對(duì)生物大分子進(jìn)行力學(xué)操作?？傮w上，AFM擁有原子級(jí)的高分辨率，可以觀察活的生物樣品，能夠?qū)悠愤M(jìn)行力學(xué)操縱，這些特性使AFM在生物大分子超微結(jié)構(gòu)與生物力學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

1.AFM在生物大分子超微結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

(1)蛋白分子：由于膜蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和研究條件不成熟等因素，以前對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)較少，AFM的出現(xiàn)為膜蛋白結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)提供了先進(jìn)手段。蛋白質(zhì)分子在脂膜上有規(guī)律地排列甚至形成二維晶體，均適合于用AFM研究[2]。低信噪比的AFM可用來來檢測(cè)膜蛋白的原子結(jié)構(gòu)，高信噪比的AFM則可直接對(duì)膜蛋白在納米級(jí)分辨率清晰成像；特殊信噪比的AFM可使膜蛋白在接近生理狀態(tài)下成像，水平分辨率達(dá)到0.5～1nm。垂直分辨率可達(dá)0.1～0.2 nm。隨著AFM探針技術(shù)的發(fā)展，最近對(duì)蛋白的研究已達(dá)到可以同時(shí)對(duì)多種參數(shù)進(jìn)行計(jì)量和測(cè)算的程度。游離蛋白不易在載體上被固定，其成像質(zhì)量往往不及膜蛋白，但AFM還是能夠比較成功地觀察肌動(dòng)蛋白、血纖維蛋白原、免疫球蛋白等游離蛋白分子。如對(duì)肌動(dòng)蛋白的觀察，早期用AFM獲得的圖像中可看到5 nm高隆起的肌動(dòng)蛋白分子結(jié)構(gòu)，隨著探針技術(shù)的不斷發(fā)展，逐步觀測(cè)到了肌動(dòng)蛋白分子的螺旋構(gòu)造，現(xiàn)今用輕敲模式不僅觀測(cè)到70nm長(zhǎng)的D帶區(qū)，就連區(qū)內(nèi)的亞結(jié)構(gòu)也能觀察。通過AFM對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合、解聚、破裂、彈性系數(shù)變化等過程的觀察，證實(shí)了肌動(dòng)蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)活細(xì)胞穩(wěn)定性的決定作用。

(2)脫氧核糖核酸：自從Lindsay等首次用AFM獲得脫氧核糖核酸的圖像以來，AFM已經(jīng)成為研究核酸分子結(jié)構(gòu)的重要工具[3]。Bustamante等用AFM在室溫和干燥空氣條件下得到質(zhì)粒DNA的圖像，可以清晰地觀測(cè)到三維環(huán)狀DNA分子的結(jié)構(gòu)，并可估算分子的寬度和高度[4]。Claudio等觀察了在不同的濕度下DNA構(gòu)型的變化,如A-型、B-構(gòu)型、Z-構(gòu)型等[5]。更大的核酸結(jié)構(gòu)如核小體和染色體包括染色體定位、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)移和小分子DNA交互作用等同樣可用AFM來研究。Tiner等利用AFM觀察到了三鏈DNA (H-DNA)結(jié)構(gòu)，并得到H-DNA與雙鏈DNA的厚度明顯不同,經(jīng)過仔細(xì)測(cè)量發(fā)現(xiàn)H-DNA的結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有理論模型符合得很好[6]。Jiao等動(dòng)態(tài)觀察了p53蛋白和DNA的相互作用，實(shí)驗(yàn)觀察到p53與DNA結(jié)合、分開及其在DNA上滑動(dòng)等現(xiàn)象,甚至發(fā)現(xiàn)了p53與DNA特異的序列結(jié)合[7]。Sahin等利用AFM進(jìn)行了G-顯帶染色體的觀察,發(fā)現(xiàn)在染色體顯帶區(qū)域染色質(zhì)濃密凝集,而非顯帶區(qū)染色質(zhì)則松散,而姐妹染色體常在此區(qū)域借助染色體絲來相互聯(lián)系[8]。

(3)多糖：生物學(xué)上多糖的復(fù)雜性和重要性不言而喻，雖然多糖分子往往帶有支鏈，分子的均一性及線性不如DNA和蛋白質(zhì)好，但用AFM可以清楚地觀測(cè)多糖分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)與二維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并可研究多糖濃度及幾種離子在不同濃度下對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的影響。Baldwin等用AFM研究了土豆和小麥淀粉顆粒表面。兩類淀粉具有不同的表面形貌，土豆淀粉粒表面有許多突起部分，直徑在100～300 nm，在相對(duì)平坦的面上包含一些10～50 nm的微結(jié)構(gòu)；而小麥淀粉的突起部分相當(dāng)少，表面較平滑。Baldwin等認(rèn)為這些突起部分代表淀粉顆粒表面的支鏈淀粉側(cè)鏈簇的末端，與“blocklets”結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)[9]。而Leslaw等用非接觸式AFM系統(tǒng)地研究了各類淀粉顆粒表面的拓?fù)湫蚊?，發(fā)現(xiàn)玉米淀粉和木薯淀粉的顆粒表面比馬鈴薯淀粉顆粒表面要平滑，后者的顆粒表面有高達(dá)1μm的突起[10]。Andrew利用接觸式AFM觀察到淀粉顆粒內(nèi)部的納米結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)玉米淀粉顆粒內(nèi)部生長(zhǎng)環(huán)之間有400～500 nm的阻隔帶。且發(fā)現(xiàn)在制樣過程中由于切割刀的作用將淀粉顆粒生長(zhǎng)阻隔帶(block)處拔出90 nm深的坑[11]。McIntire等用非接觸模式AFM觀察了直鏈淀粉的納米結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉分子在水溶液中分散較好，在75個(gè)淀粉分子中，平均等高線長(zhǎng)為230.7 nm[12]。

2. AFM在生物力學(xué)研究中的應(yīng)用

生物體內(nèi)幾乎所有的物理化學(xué)過程都與生物分子結(jié)構(gòu)中某些特異位置之間的弱鍵作用相關(guān)。根據(jù)簡(jiǎn)單模型得到的生物分子間的作用力需經(jīng)過理論計(jì)算進(jìn)行推斷, 其結(jié)果太理想化因而很難真實(shí)反映生物分子的實(shí)際狀況，同時(shí)也無法動(dòng)態(tài)反映生物體內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)過程。而利用AFM可實(shí)時(shí)測(cè)量生理狀態(tài)生物分子間的作用力及細(xì)胞表面的動(dòng)態(tài)變化如：細(xì)胞間粘著力、化學(xué)基團(tuán)間的作用力、配體受體間的作用、DNA互補(bǔ)鏈和核苷堿基間的氫鍵等，進(jìn)而綜合研究生理環(huán)境中的各種生物樣品的微觀性質(zhì)[13]。

(1)細(xì)胞間粘著力：細(xì)胞的粘著對(duì)于多細(xì)胞有機(jī)體的解剖完整性方面具有重要意義。Dammer等人利用AFM測(cè)定了海藻細(xì)胞的粘著力。在生理環(huán)境中，粘著細(xì)胞間的粘著力可達(dá)400pN。一個(gè)粘附分子對(duì)之間的粘附力可承受1600個(gè)細(xì)胞的重量。分子間高度的結(jié)合力可能正是形成多細(xì)胞海藻有機(jī)體完整性的基礎(chǔ)[14]。Thie等用AFM研究了人子宮內(nèi)皮細(xì)胞系和人滋養(yǎng)型細(xì)胞(JAR)之間的黏附作用。他們將JAR功能性地結(jié)合在AFM掃描探針的尖端,然后與單層的子宮內(nèi)皮細(xì)胞層作用不同的時(shí)間段。這項(xiàng)研究第一次界定了滋養(yǎng)細(xì)胞和子宮內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用[15]。Kim等用光鏡和原子力顯微鏡對(duì)鼠成骨細(xì)胞間的黏附力作用進(jìn)行了定性與定量研究，這對(duì)于研究多細(xì)胞生物體中細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用是一個(gè)非常重要的啟示[13]。

(2)化學(xué)基團(tuán)間作用：生物大分子是由許多相互關(guān)聯(lián)的功能團(tuán)組成，這些功能團(tuán)間的作用力決定生物大分子的整體屬性。Frisbie等人利用經(jīng)親水分子功能化的AFM探針，測(cè)量了單層有機(jī)分子的粘著力和摩擦力，再現(xiàn)了特殊功能基團(tuán)的二維形貌圖。實(shí)驗(yàn)表明,在簡(jiǎn)單的疏水分子--疏水分子、疏水分子--親水分子和親水分子--親水分子間的粘合作用可以多次重復(fù)測(cè)量。功能基團(tuán)間粘著作用的方向與預(yù)期的結(jié)果基本一致，即在親水基團(tuán)間的相互作用大于疏水基團(tuán)間的相互作用，從而能夠形成氫鍵；在各種基團(tuán)的作用力中，相同基團(tuán)間的相互作用最強(qiáng)，而不同基團(tuán)間的相互作用最弱；基團(tuán)間粘附作用大于這些測(cè)量中的不確定性，并且可以多次重復(fù)測(cè)量，因而可以根據(jù)測(cè)得的粘附力的大小可以判斷這些功能基團(tuán)[16]。

(3)配體-受體作用： Wong將AFM探針用抗生物素蛋白衍生化,將瓊脂糖的珠粒用生物素、去硫生物素或亞胺生物素功能基化,測(cè)定衍生化探針與功能基化瓊脂糖的珠粒之間的作用力。試驗(yàn)證明生物素類似物與抗生物素單分子間的力是由量子化的力單位組成的。并以類似方式測(cè)定了抗生物素--生物素同類物間的作用力，結(jié)果顯示不同的抗生物素--生物素分子間的去結(jié)合力不同；相應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)能量研究表明，去結(jié)合力與自由能ΔG的變化無關(guān)而與焓變?chǔ)有明確的線性關(guān)系，其比例因子由結(jié)合勢(shì)Reff=ΔHFu給出,其中Fu是去結(jié)合力[17]。

(4)DNA互補(bǔ)鏈和核苷堿基間的氫鍵：Lee等人測(cè)定了DNA互補(bǔ)鏈間的相互作用力，將DNA寡聚核苷酸共價(jià)結(jié)合在探針和基底的表面，利用AFM測(cè)量了DNA互補(bǔ)鏈之間的作用力；如果有第三個(gè)長(zhǎng)DNA偶聯(lián)于互補(bǔ)鏈之間，則可以觀察到鏈內(nèi)和鏈間的作用力。Antoranz等的研究結(jié)果表明AFM不僅可以測(cè)定特異堿基對(duì)之間的相互作用,而且經(jīng)由原子力顯微鏡測(cè)量的這類相互作用能很好地與Watson- Crick模型相符合[18]。Ratner等人的實(shí)驗(yàn)表明核苷堿基對(duì)的氫鍵作用具有量子化特征,并指出該量子化單位值恰好為一個(gè)堿基對(duì)間的作用力；另外，力測(cè)量試驗(yàn)顯示：腺嘌呤--胸腺嘧啶作用曲線上有兩個(gè)最低值，一個(gè)是氫鍵作用，一個(gè)是常規(guī)作用；無論胸腺嘧啶過量與否,常規(guī)作用的曲線相同；但若加入可溶性胸腺嘧啶,氫鍵峰值則減小7倍；從上述試驗(yàn)事實(shí)可知，在溶液中加入過量的胸腺嘧啶可以專門抑制腺嘌呤尖端與胸腺嘧啶表面的相互作用[19]。

3. AFM在生物大分子研究中的應(yīng)用前景

AFM作為一種顯微探測(cè)工具，25年來，已被廣泛地應(yīng)用于在生物學(xué)各領(lǐng)域，與以往的各種顯微工具相對(duì)比，AFM以其分辨率高、樣品制備簡(jiǎn)便、制樣過程對(duì)樣品原始形態(tài)影響小、能在生理?xiàng)l件下進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究等優(yōu)點(diǎn)備受青睞。基因診斷和基因治療已成為提高醫(yī)療水平的熱點(diǎn)，在此人們便需要對(duì)生物分子進(jìn)行分子和原子水平結(jié)構(gòu)和形態(tài)的直接觀察和研究，而AFM正好能夠滿足這種要求。另外，基因組計(jì)劃大規(guī)模測(cè)序工作已基本完成，人們將視線聚焦到了后基因組即蛋白質(zhì)組的研究上。而想要了解蛋白質(zhì)的功能首先要了解其結(jié)構(gòu)，AFM提供了這樣一個(gè)平臺(tái)。在這個(gè)平臺(tái)上我們不僅可以觀察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并了解其功能,還可以動(dòng)態(tài)觀察蛋白間的相互作用以及蛋白質(zhì)與DNA、RNA間的相互作用，這樣就可以進(jìn)一步了解蛋白結(jié)構(gòu)域的功能情況，并由此推斷擁有此結(jié)構(gòu)域的蛋白的功能。另外，腫瘤的診斷與治療仍是一大挑戰(zhàn)性課題。AFM可通過對(duì)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)來判斷腫瘤的類型與屬性，從而起到腫瘤診斷作用；作為一種力學(xué)操縱手段，AFM可對(duì)生物標(biāo)本進(jìn)行直接切割、鉆孔、打磨等操作，從而能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行納米級(jí)的人工操作，以達(dá)到對(duì)病理細(xì)胞進(jìn)行“手術(shù)”的目的，這樣便有可能對(duì)腫瘤進(jìn)行治療。盡管AFM研究中還存在針尖污染、針尖對(duì)樣品的影響等不利因素，但隨著納米管技術(shù)的不斷發(fā)展，探針制造工藝的不斷改進(jìn)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步[20]，可以預(yù)見，AFM必將為大分子生物學(xué)的研究帶來突破性進(jìn)展。

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