于文娟朱浩盧衛(wèi)紅金志興朱麗萍

·論 著·

MK-801建立谷氨酸功能低下精神分裂癥大鼠模型的研究☆

于文娟*朱浩△盧衛(wèi)紅*金志興*朱麗萍*

目的 用N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）非競爭性受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK801）建立具有類精神分裂癥癥狀的大鼠模型。方法 24只SD大鼠隨機分為MK801組、生理鹽水組和正常對照組，每組各8只。MK801組的大鼠每天腹膜腔內(nèi)注射0.5 mg／kg（給藥體積為10 mL／kg）MK801共6 d以建立精神分裂癥模型，生理鹽水組給予等體積生理鹽水。用自發(fā)活動、強迫游泳試驗、逃避性抑制（inhibitory avoidance，IA）試驗以及海馬神經(jīng)生長因子表達(dá)評價該模型。結(jié)果 MK801組、生理鹽水組和對照組的大鼠10min自發(fā)活動總路程分別為（3127±381）cm、（935±196）cm、（1060±243）cm，游泳不動時間分別為（147±18）s、（58± 10）s、（52±10）s。3組的自發(fā)活動和游泳不動時間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （F＝149.7，P＜0.01；F＝122.6，P＜0.01），MK801組的自發(fā)活動較另兩個組均增加（P＜0.01），而游泳不動時間延長（P＜0.01）。3組的24 h IA的記憶潛伏期也有明顯差異（F＝5.2，P＜0.05），MK801組的記憶潛伏期［（26±10）s］較生理鹽水組［（47±16）s］和對照組［（46±14）s］均縮短（P＜0.05）。而且，MK801組海馬神經(jīng)生長因子表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論 連續(xù)給予高劑量MK801誘導(dǎo)的大鼠谷氨酸功能低下模型不僅具有類精神分裂癥癥狀，而且還存在神經(jīng)生物學(xué)改變，可作為模擬精神分裂癥的模型。

MK801 精神分裂癥 大鼠模型 神經(jīng)生長因子

精神分裂癥（schizophrenia）是一類常見的精神疾病，發(fā)病機理至今仍不清楚，因此建立合適的動物模型對研究該病具有重要意義。用N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）非競爭性受體拮抗劑地卓西平馬來酸鹽（MK801）誘導(dǎo)精神分裂癥模型已被廣泛使用，但在建立大鼠模型時所使用的劑量以及給藥持續(xù)的時間都不一致，并且評價指標(biāo)單一。國內(nèi)多數(shù)研究者在建立該疾病大鼠模型時，使用的劑量參照吳金華等［1］或蘇允愛等［2］研究的劑量，但他們的研究對象是小鼠，而且沒有檢測認(rèn)知功能以及生化因子變化。近來，研究發(fā)現(xiàn)腹膜腔內(nèi)連續(xù)6 d注射高劑量MK-801（0.5 mg／kg）的大鼠扣帶等腦區(qū)谷氨酸和谷氨酰胺濃度明顯升高［3］，這與首發(fā)精神分裂癥患者腦區(qū)代謝變化相似［4］。重復(fù)注射MK-801可能誘導(dǎo)與精神分裂癥患者更相似的腦生化改變，可能獲得更好的模擬精神分裂癥患者的模型。故本研究以連續(xù)給予高劑量MK801建立精神分裂癥大鼠模型，并從行為學(xué)以及生化因子表達(dá)等方面評價此模型。

1 材料與方法

1.1 研究對象 清潔級成年雄性Spragus-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗科學(xué)部提供。動物生產(chǎn)和使用許可證號碼分別為SCXK（滬）2004－0001和SYXK（滬）2003－0026。大鼠隨機分為3組，即MK801組、生理鹽水組（NS組）和正常對照組，每組8只。實驗前在動物房飼養(yǎng)至少3 d，維持室溫（23±1）℃，采用12 h晝夜節(jié)律（8：00～20：00）。所有實驗都在9：00～17：00之間完成。整個實驗過程中飲水及進(jìn)食均自由。

1.2 藥物及處理 地卓西平馬來酸鹽（dizocilpine，（＋）-MK-801；美國Sigma公司），溶于生理鹽水，配置成5 mg／mL的儲備液。MK801組以0.5 mg／kg（給藥體積為10 mL／kg）MK801腹膜腔內(nèi)注射，每天1次，連續(xù)6 d；而生理鹽水組以同樣的方式給予等體積生理鹽水；正常對照組為未經(jīng)處理的正常大鼠。

1.3 行為學(xué)檢測 末次給藥30 min后，先行各組大鼠的自發(fā)活動檢測，隨后行逃避性抑制試驗（inhibitory avoidance，IA），最后進(jìn)行強迫游泳實驗。

1.3.1 自發(fā)活動 大鼠的自發(fā)活動采用Smart-128小動物行為分析系統(tǒng)（西班牙Panlab公司）。各組大鼠于末次給藥30 min后，將單只大鼠放入頂部內(nèi)置有攝像頭的觀察箱（42 cm×42 cm×30 cm），對大鼠活動進(jìn)行視頻跟蹤，自動記錄大鼠活動軌跡，計算活動路程。自發(fā)活動評價的指標(biāo)是：大鼠一定時間段內(nèi)（如10 min）的活動總路程，即總路程變長顯示自發(fā)活動增加。

1.3.2 逃避性抑制試驗 給藥第5 d，將大鼠背朝隔離門置入IA訓(xùn)練儀的明室中，當(dāng)大鼠面向升降門時，把門升起，暴露暗室。當(dāng)大鼠四足全部邁進(jìn)暗室時即將升降門關(guān)閉，給予大鼠足部單次電擊（0.4 mA，2 s），隨后將大鼠取出。24 h后，檢測大鼠IA記憶：將大鼠再次置入IA訓(xùn)練儀的明室中，記錄大鼠進(jìn)入暗室前在明室內(nèi)停留的時間 （潛伏期）。潛伏期越長代表大鼠記憶越好。潛伏期上限為600 s，超過亦記作600 s。

1.3.3 強迫游泳試驗 各組大鼠于末次給藥后，單只放入水溫（23±1）℃、水深30 cm、高40 cm、直徑25 cm的玻璃容器中，記錄大鼠5 min內(nèi)累計不動的時間。不動指標(biāo)為動物僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動以保持身體懸浮，或下沉接觸水池底部超過1 s時間。每只大鼠游泳前更換溫水。

1.4 神經(jīng)生長因子檢測 行為學(xué)測試結(jié)束后，大鼠斷頭取雙側(cè)海馬，用RIPA（Sigma公司）裂解液提取蛋白，經(jīng)BCA （Pierce公司）蛋白定量后行western blotting檢測神經(jīng)生長因子 （nerve growth factor，NGF）。蛋白變性后，經(jīng)加樣、電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉，再用 anti-NGF一抗（Santa cruz公司，1∶400）4℃孵育過夜。而后加入二抗室溫孵育，ECL（Pierce公司）曝光顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。三組比較采用方差分析（ANOVA）檢驗，兩兩多重比較采用LSD。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MK801誘導(dǎo)大鼠自發(fā)活動增加 末次給藥30 min后，MK801組、NS組和對照組的10 min內(nèi)自發(fā)活動總路程的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝149.7，P＜0.01），前者明顯高于后兩組（P＜0.01），但NS組與對照組無差異（P﹥0.05）。見圖1。

2.2 MK801降低大鼠IA的潛伏期 IA試驗中，MK801組、NS組和對照組大鼠24 h記憶保持的時間（潛伏期）的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝5.2，P＜0.05），前者明顯低于后兩組（P＜0.01），但 NS組與對照組無差異（P﹥0.05）。見圖2。

2.3 MK801延長大鼠強迫游泳靜止的時間

MK801組、NS組和對照組大鼠強迫游泳5 min內(nèi)總不動時間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝122.6，P＜0.01），前者明顯高于后兩組（P＜0.05），但NS組與對照組無差異（P﹥0.05）。見圖3。

2.4 MK801下調(diào)大鼠海馬NGF表達(dá) Western blotting檢測顯示，MK801組大鼠海馬NGF表達(dá)明顯下調(diào)，而NS組NGF表達(dá)無明顯變化。見圖4。

3 討論

谷氨酸功能低下已經(jīng)被認(rèn)為在精神分裂癥發(fā)病機制中具有重要作用。NMDA受體拮抗劑可使正常人產(chǎn)生類精神分裂癥的癥狀，并能加劇精神分裂癥患者原有癥狀［5］。與多巴胺能激動劑只能產(chǎn)生陽性癥狀相比，NMDA受體拮抗劑能誘導(dǎo)出現(xiàn)整個精神分裂癥疾病譜，包括陰性癥狀以及認(rèn)知缺陷［6］。單次高劑量或連續(xù)低劑量MK801（0.1 mg／kg，6 d）主要誘導(dǎo)大鼠腦部顳葉谷氨酸鹽及谷氨酰胺濃度增加［7－9］，而精神分裂癥患者卻是扣帶、額前皮質(zhì)、海馬等腦區(qū)谷氨酸和谷氨酰胺濃度明顯升高［4］，表明單次高劑量或連續(xù)低劑量建立的模型不能很好地模擬精神分裂癥。近來研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)高劑量MK801誘導(dǎo)的大鼠腦區(qū)代謝變化與精神分裂癥患者的一致［3］，但連續(xù)給予高劑量MK801誘導(dǎo)的模型具有的癥狀卻未評價。

本研究中通過自發(fā)活動、強迫游泳試驗、IA試驗等多種行為學(xué)方法評價高劑量MK801誘導(dǎo)的精神分裂癥模型大鼠。自發(fā)活動試驗是觀察自然狀態(tài)下實驗動物的活動情況，NMDA受體拮抗劑誘導(dǎo)嚙齒類動物活動增多被作為精神分裂癥陽性癥狀［10］；NMDA受體拮抗劑誘導(dǎo)動物強迫游泳不動時間延長可作為精神分裂癥陰性癥狀的行為模型，強迫游泳不動時間延長可反映精神分裂癥陰性癥狀［11］。IA試驗是利用大鼠趨暗喜黑的天性，檢測大鼠相關(guān)記憶的一種方法，24 h潛伏期縮短表明實驗動物記憶保持下降。本研究結(jié)果顯示，與生理鹽水組和空白對照組比較，連續(xù)腹腔內(nèi)注射高劑量MK801可顯著增加模型組大鼠自發(fā)活動，延長強迫游泳不動時間，縮短24 h記憶保持的時間，表明該模型的大鼠行為紊亂、記憶力下降等，可很好地模擬精神分裂癥患者的陽性、陰性癥狀以及認(rèn)知障礙。

圖1 各組大鼠自發(fā)活動10 min總路程的比較

圖2 各組大鼠24 h記憶潛伏期的比較

圖3 各組大鼠強迫游泳試驗中不動時間的比較

圖4 Western botting檢測大鼠海馬NGF表達(dá)

有研究表明NMDA受體拮抗劑可致強迫游泳不動時間縮短［12］，而本研究連續(xù)高劑量MK801可延長強迫游泳不動時間，表明模型大鼠模擬了精神分裂癥的陰性癥狀。此不一致的結(jié)果可能是由于以下兩種原因：給藥劑量和給藥時間。MK-801縮短強迫游泳不動時間具有明顯的劑量關(guān)系，高劑量時才可導(dǎo)致不動時間縮短［12－13］。而在此劑量范圍，MK-801又能誘導(dǎo)自主活動能力增加［13］，所以不排除藥物縮短強迫游泳不動時間是自主活動能力增加導(dǎo)致的，可能是假陽性結(jié)果。另外，以上研究都是單次給藥，而本實驗是連續(xù)6 d給藥。另一個NMDA受體拮抗劑－PCP誘導(dǎo)強迫游泳不動時間延長也有時間條件：連續(xù)給藥兩周可增加強迫游泳不動時間，而單次或連續(xù)5 d給藥卻沒有導(dǎo)致強迫游泳不動時間延長［11］。

NGF是維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長、發(fā)育和分化的必需營養(yǎng)因子。精神分裂癥患者不僅血清中NGF水平改變，腦組織、腦脊液中NGF水平也發(fā)生變化。研究顯示，首發(fā)未服藥的精神分裂癥患者血清NGF水平顯著低于正常人群，而且血清NGF水平與患者陰性癥狀有關(guān)，而典型或非典型抗精神病藥物都能使NGF血清水平升高［14］。Parikh等［14］檢測精神分裂癥模型大鼠血清和腦NGF水平變化也獲得與人一致的結(jié)果。以上研究表明NGF與精神分裂癥發(fā)病機理以及藥物治療有關(guān)。本研究顯示連續(xù)給予高劑量MK801可導(dǎo)致大鼠海馬中NGF水平明顯下降，說明連續(xù)給予高劑量MK801可誘導(dǎo)相似于精神分裂癥患者生化因子變化，同時也進(jìn)一步支持該模型可更好模擬精神分裂癥。

［1］ 吳金華，鄒洪，于軍，等.用不同實驗小鼠品系建立精神分裂癥的動物模型［J］.生理學(xué)報，2003，55（4）：381－387.

［2］ 蘇允愛，司天梅，周東豐，等.MK-801建立谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型的研究［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2006，32（6）：558－560.

［3］Kondziella D，Brenner E，Eyjolfsson EM，et al.Glial-neuronal interactions are impaired in the schizophrenia model of repeated MK801 exposure［J］.Neuropsychopharmacology，2006，31（9）：1880－1887.

［4］van Elst LT，Valerius G，Büchert M，et al.Increased prefrontal and hippocampal glutamate concentration in schizophrenia： evidence from a magnetic resonance spectroscopy study［J］.Biol Psychiatry，2005，58（9）：724－730.

［5］Manahan-Vaughan D，von Haebler D，Winter C，et al.A single application of MK801 causes symptoms of acute psychosis，deficits in spatial memory，and impairment of synaptic plasticity in rats［J］.Hippocampus，2008，18（2）：125－134.

［6］Carlsson A，Waters N，Holm-Waters S，et al.Interactions between monoamines，glutamate，and GABA in Schizophrenia：new evidence［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41：237－260.

［7］Brenner E，Kondziella D，Haberg A，et al.Impaired glutamine metabolism in NMDA receptor hypofunction induced by MK801［J］.J Neurochem，2005，94（6）：1594－1603.

［8］Eyjolfsson EM，Brenner E，Kondziella D，et al.Repeated injection of MK801：an animal model of schizophrenia？［J］.Neurochem Int，2006，48（6－7）：541－546.

［9］ 李文強，郭偉云，張紅星，等.谷氨酸能低下精神分裂癥模型大鼠不同腦區(qū)核因子κB表達(dá)分析［J］.中國神經(jīng)精神疾病雜志，2009，35（11）：646－649.

［10］Gainetdinov RR，Mohn AR，Caron MG.Genetic animal models：focus on schizophrenia［J］.Trends Neurosci，2001，24（9）：527－533.

［11］Mouri A， Noda Y， Enomoto T， et al.Phencyclidine animal models of schizophrenia：approaches from abnormality of glutamatergic neurotransmission and neurodevelopment［J］.Neurochem Int，2007，51（2－4）：173－184.

［12］Molina-Hernández M， Téllez-Alcántara NP， Pérez-García J，et al.Desipramine or glutamate antagonists synergized the antidepressant-like actions of intra-nucleus accumbens infusions of minocycline in male Wistar rats［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2008，32（7）：1660－1666.

［13］Ghasemi M，Raza M，Dehpour AR.NMDA receptor antagonists augment antidepressant-like effects of lithium in the mouse forced swimming test［J］.J Psychopharmacol，2010，24（4）：585－594.

［14］Parikh V，Evans DR，Khan MM，et al.Nerve growth factor in never-medicated first-episode psychotic and medicated chronic schizophrenic patients： possible implications for treatment outcome［J］.Schizophr Res，2003，60（2－3）：117－123.

Establishment of a MK801-induced glutamate dysfunction model of schizophrenia in rats.

YU Wenjuan，ZHU Hao， LU Weihong， JIN Zhixing， ZHU Liping.Shanghai Mental Health Centre， Shanghai Jiaotong University School of Medicine，No.600 South Wanping Road，Shanghai 200025，China.Tel：021－64901737.

Objective To establish a rat glutamate dysfunction model of schizophrenia using MK801，a noncompetitive antagonist for the NMDA-type of glutamate receptors.Methods Twenty-four SD rats were randomly divided into three groups：MK801，vehicle（normal saline）and control groups.Rats in MK801 group were administrated intraperitoneally with MK801 （0.5 mg／kg， 10 mL／kg body weight） while rats in vehicle group were administered intraperitoneally with an equal volume of saline normal saline every day for 6 consecutive days.The behaviors were evaluated by locomotor activity，forced swimming test，inhibitory avoidance（IA）training and the expression of nerve growth factor（NGF） was detected in rat hippocampus.Results The locomotion in MK801 group was significantly increased［（3127±381）cm］compared with vehicle group［（935±196）cm］and control group［（1060±243）cm］（F＝149.7，P＜0.01）.In addition，the immobility time of swimming in MK801 group was also significantly increased［（147±18）s］compared with vehicle group［（58±10）s］and control group［（52±10）s］（F＝122.6，P＜0.01）.However，24-h IA memory retention latency in MK801 group［（26±10）s］was significantly decreased compared with vehicle group［（47 ±16）s］and control group［（46±14）s］（F＝5.2，P＜0.05）.The level of NGF was downregulated in MK801 group.Conclusion Repeated high dose MK801-induced glutamate dysfunction model not only mimics symptoms of schizophrenia but also induces neurobiological changes，which may serve as a model of schizophrenia.

MK801 Schizophrenia Rat modelNerve growth factor

R749.3

A

2011－05－06）

（責(zé)任編輯：曹莉萍）

☆ 上海市精神衛(wèi)生中心基金（編號：09-YJ-08），上海市科學(xué)技術(shù)委員會中藥現(xiàn)代化專項（編號：10DZ1973300）

* 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心（上海 200030）

（Email：zhulipingjsk＠yahoo.com.cn）

△ 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室