石松生陳春美楊衛(wèi)忠王春華王銳金昌丹

rAAV-AsiNOS抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究☆

石松生*陳春美*楊衛(wèi)忠*王春華*王銳*金昌丹*

目的 探討攜帶誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）反義RNA重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）載體（rAAV-AsiNOS）對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響以及對(duì)iNOS和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等表達(dá)的影響。方法 根據(jù)C6細(xì)胞培養(yǎng)基成分不同分為3組，即空白組［含10%胎牛血清的改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液，n＝4］、β-半乳糖苷酶基因（β-galactosidase gene z，lacz）重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV-LacZ）組（含有rAAV-LacZ的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n＝4）和rAAV-AsiNOS組（含有rAAV-AsiNOS的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，n＝4），C6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；3組同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)1、3、6、12、24 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)C6細(xì)胞中NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比、iNOS和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比，應(yīng)用半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（RT-PCR）分析iNOS和VEGF mRNA表達(dá)。結(jié)果 一定感染復(fù)數(shù)的重組病毒載體rAAV-LacZ對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯影響，而rAAV-AsiNOS重組病毒載體在轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞從3d開始出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，NT、iNOS和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞在空白組和rAAV-LacZ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6h開始出現(xiàn)NT、iNOS和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比下降， NT百分比分別為9.37%± 1.2%，97.3%±0.75%和4.62%±0.53%；iNOS百分比分別為18.42%±2.17%，14.29%±1.44%和 8.31%±1.30%；VEGF百分比分別為7.85%±0.98%，6.32%±0.78%和 5.04%±0.41%，較空白組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，同一時(shí)間中，iNOS mRNA在空白組和rAAV-LacZ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6h開始出現(xiàn)iNOS mRNA表達(dá)下降，分別為0.46±0.04，0.34±0.03和0.21±0.03，較同一時(shí)間空白組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 攜帶iNOS反義RNA腺相關(guān)病毒載體rAAV-iNOS能夠抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，能夠抑制iNOS表達(dá)，從而通過抑制VEGF基因表達(dá)發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的重要作用。

膠質(zhì)瘤iNOS 重組腺相關(guān)病毒載體 VEGF 細(xì)胞增殖

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）廣泛參與了膠質(zhì)瘤的血管生成、增殖與凋亡以及化療耐受等過程，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。針對(duì)iNOS的“靶點(diǎn)治療”，可能是膠質(zhì)瘤綜合治療的一條新途徑。本實(shí)驗(yàn)在前期成功構(gòu)建了攜帶iNOS反義RNA的重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV-AsiNOS）基礎(chǔ)上［2］，探討iNOS反義RNA基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，為膠質(zhì)瘤治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 攜帶iNOS反義RNA的重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV-AsiNOS）以及攜帶半乳糖苷酶基因（LacZ）的腺相關(guān)病毒載體（rAAV-LacZ）由我所成功構(gòu)建［2］，大鼠膠質(zhì)瘤 C6細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。兔抗鼠的硝基酪氨酸（nucleotide，NT）、iNOS、VEGF單克隆一抗體和FITC標(biāo)志（標(biāo)記綠色熒光）的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Trizol試劑盒和RT-PCR kit（二步法）購(gòu)自 Promega（美國(guó)），iNOS引物由上海生物工程公司合成。

1.2 重組腺相關(guān)病毒載體對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線影響 在24孔板中每孔接種2×103個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)50%左右，棄去培養(yǎng)基后，分別換成含有重組腺相關(guān)病毒載體 （rAAV-AsiNOS和rAAV-LacZ）的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加入的重組病毒按感染復(fù)數(shù) （multiplicity of infection，MOI）100，分別為rAAV-AsiNOS組和rAAV-LacZ組，設(shè)立空白組（即10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液），置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)， 觀察形態(tài)，共3組，每天從每組取4孔細(xì)胞，消化，離心后計(jì)數(shù) ，連續(xù)觀察7 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3 rAAV-AsiNOS抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 在24孔板中每孔接種1×105個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)60%左右，棄去培養(yǎng)基后，分別換成含有重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV-AsiNOS和rAAV-LacZ）的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，每孔加入的重組病毒按MOI 100，設(shè)立空白組（即10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液）。置37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)1、3、6、12、24 h后，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比 收集各組不同培養(yǎng)時(shí)間的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，依次加入稀釋好的一抗兔抗鼠的NT單克隆抗體，室溫下共孵育30 min，洗滌、離心。加入二抗FITC標(biāo)志（標(biāo)記綠色熒光）的羊抗兔IgG，共孵育30 min，離心、洗滌，上機(jī)檢測(cè)。定量分析NT陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度和NT陽(yáng)性細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，計(jì)算NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比。NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比＝NT陽(yáng)性細(xì)胞絕對(duì)數(shù)／（NT陽(yáng)性細(xì)胞絕對(duì)數(shù) ＋NT陰性細(xì)胞絕對(duì)數(shù)）×100%。

1.3.3 FCM定量檢測(cè)iNOS和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比 收集各組不同培養(yǎng)時(shí)間的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，依次分別加入兔抗鼠的iNOS、VEGF單克隆一抗體和二抗FITC標(biāo)志 （標(biāo)記綠色熒光）的羊抗兔IgG，上機(jī)檢測(cè)，獨(dú)立重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.3.4 半定量RT-PCR分析iNOS mRNA 收集各組不同培養(yǎng)時(shí)間的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用Trizol試劑抽提RNA，計(jì)算總RNA濃度，取總RNA 2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。再以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液2 μL作為模板，加入相應(yīng)引物（β-actin內(nèi)參照）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體積50 μL。所用引物分別為iNOS（正義鏈5′-TCGAGCCCTGGAAGACCCACATCT-3′；反義鏈 5′-GTTGTTCTT CTTCCAAGGTGTTTGCCTTAT-3′），β-actin（正義鏈 5′-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3′；反義鏈5′-CAGCACTGTGTTGGCA TAGA 3′）。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min（以上步驟循環(huán)35次），最后72℃繼續(xù)延伸7 min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，美國(guó)伯樂BIO-RAD Gel DocTM XR凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相，獨(dú)立重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)，以β-actin內(nèi)參照作為內(nèi)標(biāo)，與同步產(chǎn)物進(jìn)行比較，對(duì)PCR產(chǎn)物相對(duì)定量，應(yīng)用quantity-one分析軟件半定量分析，計(jì)算所得產(chǎn)物的積分光密度與各自內(nèi)參照積分光密度的比值來(lái)反映該iNOS mRNA的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性分析后再進(jìn)行兩組間比較，采用q檢驗(yàn)分析，檢測(cè)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組腺相關(guān)病毒載體對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響 與同一時(shí)間空白組C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞比較，一定感染復(fù)數(shù)（MOI 100）的rAAV-LacZ重組病毒載體對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)明顯影響，而rAAV-AsiNOS重組病毒載體在轉(zhuǎn)染3 d開始出現(xiàn)C6細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 FCM檢測(cè)NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在含有重組病毒載體AAV-AsiNOS培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h開始，NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比較空白組和AAV-LacZ組的明顯下降，并隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)百分比下降，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 FCM定量檢測(cè)iNOS、VEGF和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分比

定量FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組和rAAV-LacZ組之間iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6 h開始出現(xiàn)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比下降，較空白組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

VEGF陽(yáng)性細(xì)胞空白組和rAAV-LacZ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6 h開始出現(xiàn)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比下降，較空白組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表4）。

2.4 半定量RT-PCR分析iNOS mRNA基因表達(dá)水平 所有組別提取的總 RNA的λ值（OD260／OD280）在 1.86至1.97之間，說(shuō)明總RNA濃度合適，總RNA在2.0%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示均可見三條帶，表明所提取的RNA未見降解。半定量PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，iNOS和β-actin mRNA的特異性片段大小分別為276 bp和201 bp。iNOS mRNA在不同組別中均有不同程度表達(dá)，其中，同一時(shí)間空白組和rAAVLacZ組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；而rAAV-iNOS組從培養(yǎng)6 h開始出現(xiàn)iNOS mRNA表達(dá)下降，與空白組同一時(shí)間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表5，圖1～3）。

3 討論

本課題組在實(shí)驗(yàn)前期工作中已經(jīng)成功地構(gòu)建了攜帶iNOS反義RNA基因片斷重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV-AsiNOS）并引入腺相關(guān)病毒載體rAAV-LacZ作為對(duì)照載體，成功地應(yīng)用于研究iNOS在腦缺血發(fā)病機(jī)制作用研究［3］。本實(shí)驗(yàn)將這種重組腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與空白組比較，發(fā)現(xiàn)一定感染復(fù)數(shù)的重組病毒載體rAAV-LacZ對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并未產(chǎn)生明顯的影響，而轉(zhuǎn)染重組病毒載rAAV-Asi-NOS后C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明攜帶iNOS反義RNA基因片斷重組載體能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

將攜帶正義或反義目的基因片斷重組病毒載體轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中，使目的基因在靶細(xì)胞中表達(dá)特定的功能，或目的基因片斷抑制靶細(xì)胞特異性基因表達(dá)，這就是當(dāng)前基因治療的重點(diǎn)研究方向之一［4］。本實(shí)驗(yàn)中，將 iNOS基因片斷反向克隆到腺相關(guān)病毒載體中，構(gòu)建攜帶iNOS反義RNA腺相關(guān)病毒載體，并將重組載體轉(zhuǎn)染到C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中iNOS的表達(dá)，減少iNOS介導(dǎo)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用。

表1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在不同組別中不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)［（±s）×103，n＝4］

表1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在不同組別中不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)［（±s）×103，n＝4］

1）經(jīng)q檢驗(yàn)分析，與空白組比較，P＜0.05

組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 d 2.00±0.00 2.00±0.00 2.00±0.00 2 d 2.74±0.70 2.84±0.83 2.79±0.50 3 d 4.71±0.23 4.54±0.17 4.02±0.761）4 d 7.41±0.25 7.32±0.36 6.11±0.201）5 d 10.77±2.07 10.24±1.28 8.50±0.861）6 d 13.31±2.17 12.97±2.01 9.30±0.491）7 d 19.18±2.24 18.61±2.00 11.34±1.451）

表2 NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

表2 NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

1）經(jīng)q檢驗(yàn)分析，與空白組比較，P＜0.05

NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 12.23%±1.22% 11.44%±1.29% 12.29%±1.98% 3 h 13.96%±1.09% 12.97%±1.14% 12.86%±1.00% 6 h 14.26%±2.08% 13.23%±1.25% 9.33%±1.39%1）12 h 14.16%±0.84% 15.05%±1.02% 7.34%±0.72%1）24 h 15.79%±0.95% 14.99%±0.78% 4.57%±0.58%1）

表3 iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

表3 iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

1）經(jīng)q檢驗(yàn)分析，與空白組比較，P＜0.05

iNOS陽(yáng)性細(xì)胞百分比組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 23.40%±1.01% 24.13%±1.22% 23.68%±1.05% 3 h 24.32%±1.24% 23.93%±1.47% 22.27%±2.24% 6 h 24.6%±0.81% 24.32%±1.52% 18.54%±3.66%1）12 h 24.14%±1.14% 23.91%±0.76% 14.67%±0.78%1）24 h 25.17%±1.17% 24.44%±1.25% 8.30%±1.28%1）

表4 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

表4 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

1）經(jīng)q檢驗(yàn)分析，與空白組比較，P＜0.05

VEGF陽(yáng)性細(xì)胞百分比組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 11.36%±1.02% 11.04%±1.41% 10.74%±0.91% 3 h 11.45%±1.05% 11.98%±1.25% 10.71%±1.00% 6 h 10.49%±0.68% 11.38%±1.94% 7.32%±1.74%1）12 h 11.64%±2.33% 12.37%±1.13% 6.38%±1.47%1）24 h 12.56%±0.86% 11.80%±1.24% 5.11%±1.10%1）

表5 iNOS mRNA相對(duì)值在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

表5 iNOS mRNA相對(duì)值在不同組別不同培養(yǎng)時(shí)間的變化［±s，n＝4］

1）經(jīng)q檢驗(yàn)分析，與空白組比較，P＜0.05

iNOS mRNA相對(duì)值組別空白組rAAV-LacZ組rAAV-AsiNOS組1 h 0.56%±0.12% 0.53%±0.15% 0.51%±0.09% 3 h 0.59%±0.12% 0.56%±0.05% 0.52%±0.10% 6 h 0.62%±0.09% 0.59%±0.11% 0.46%±0.14%1）12 h 0.61%±0.11% 0.56%±0.11% 0.34%±0.06%1）24 h 0.61%±0.12% 0.57%±0.16% 0.21%±0.03%1）

圖1 空白組不同培養(yǎng)時(shí)間的iNOS mRNA表達(dá)

圖2 rAAV-LacZ組不同培養(yǎng)時(shí)間的iNOS mRNA表達(dá)

圖3 rAAV-AsiNOS組不同培養(yǎng)時(shí)間的iNOS mRNA表達(dá)

iNOS是合成一氧化氮（NO）關(guān)鍵酶，參與腫瘤新生血管生成以及擴(kuò)張血管等途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的NO在增加腫瘤血供和促進(jìn)腫瘤血管生成等方面發(fā)揮作用，iNOS和VEGF基因均參與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程，而且與膠質(zhì)瘤惡性度相關(guān)［5］。NO在體內(nèi)可與超氧陰離子（superoxide O2－）快速結(jié)合生成過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite，ONOO－），NT是ONOO－在體內(nèi)生成的特異性標(biāo)記物［6］，在整體內(nèi)NT的生成和定位可反映ONOO－的產(chǎn)生狀態(tài)與分布，NT陽(yáng)性細(xì)胞百分比能夠間接反映體內(nèi)NO的含量。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果顯示，重組病毒載體rAAV-AsiNOS轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞6 h后，iNOS陽(yáng)性細(xì)胞比、NT陽(yáng)性細(xì)胞比和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞比均出現(xiàn)不同程度下降，說(shuō)明攜帶iNOS反義基因的重組病毒載體能夠抑制膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞iNOS表達(dá)，減少NO合成，出現(xiàn)NT陽(yáng)性細(xì)胞比例下降，影響了VEGF表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。然后，重組病毒載體rAAV-LacZ并不能影響iNOS在C6細(xì)胞中的表達(dá)，NT陽(yáng)性細(xì)胞比和VEGF陽(yáng)性細(xì)胞比與空白組相仿。

iNOS和VEGF參與體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程，其主要機(jī)制可能是各種細(xì)胞因子激活了iNOS，后者催化合成NO，調(diào)控細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)成分和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。將iNOS反義RNA基因轉(zhuǎn)染到C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞腫瘤，能夠抑制iNOS基因的表達(dá)，減少NO合成和VEGF基因表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，從而達(dá)到抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖作用，也進(jìn)一步證實(shí)iNOS和VEGF之間的相關(guān)性，可能共同參與調(diào)控膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)增殖過程。

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（責(zé)任編輯：甘章平）

R743.33

A

2011－01－14）

☆ 福建省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目資助（編號(hào)：JA05259）

* 福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科 福建省神經(jīng)外科研究所（福州 350001）