王君,韓靜

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院,山西太谷 030801)

芽孢桿菌是經(jīng)常遇到的污染菌,而且有的還是致病菌;它們可以引起果蔬、糧食、乳制品、肉類、魚類、禽類、蛋類以及罐頭食品的變質(zhì)和一些食源性疾病和食物中毒[1,2]。如:蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)污染牛乳后可使其酸度不高時(shí)即可發(fā)生凝固,而且產(chǎn)生下痢疾毒素、腸毒素、溶血素、嘔吐毒素及腸管壞死毒素等引起食物中毒。巨大芽孢桿菌(B.megaterium)可使?jié)饪s乳凝固并產(chǎn)生干酪味的氣味,使肉類罐頭變質(zhì)脹罐。肉類罐裝食品中最重要的是肉毒梭狀芽孢桿菌(Cl.botulinum),其芽孢耐熱性極強(qiáng),能產(chǎn)生很強(qiáng)的毒素——肉毒毒素,人們食入含有該毒素的食品可發(fā)生毒素型食物中毒,早期癥狀為全身無力、頭痛、頭暈,繼而出現(xiàn)眼瞼下垂、視力模糊、瞳孔散大、吞咽困難等癥狀直至死亡。

由于芽孢具有高度抗逆性,因此殺滅芽孢成為衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標(biāo)。大量的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和食品研究資料都證實(shí),大蒜對芽孢桿菌屬有明顯的抑制效果。目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于對芽孢桿菌屬的抑制作用大多集中于對營養(yǎng)細(xì)胞的抑制作用研究上,較少關(guān)注芽孢。故本試驗(yàn)采用大蒜原汁為材料研究其對枯草芽孢桿菌芽孢形成和芽孢發(fā)芽的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis AS 1.1380)。

紫皮大蒜(Allium sativum L.),購于陜西省岐山縣蔡家坡。

磷酸氫二鈉,磷酸二氫鉀,冰乙酸,乙酸鈉,硫酸亞鐵銨,抗壞血酸,均為分析純。

蛋白胨,酵母浸膏,瓊脂,均為生化試劑。

2,6-吡啶二羧酸色測反應(yīng)劑[3]:pH5.5,0.5 mol?L-1乙酸鈉緩沖液100 mL,抗壞血酸、硫酸亞鐵銨各1 g,每次實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配。

大蒜原汁制備:將大蒜洗凈,去皮,用壓榨機(jī)壓榨,無菌濾紙過濾,取出原汁,置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌的顯微鏡鏡檢

當(dāng)芽孢桿菌的細(xì)胞停止生長時(shí),就開始形成芽孢。通過顯微鏡芽孢染色[4]觀察細(xì)菌不同時(shí)間生長期的形態(tài)變化,以確定其對數(shù)生長期每一個(gè)階段的具體時(shí)間,從而間接確定其芽孢形成的開始時(shí)期,為芽孢形成的試驗(yàn)提供可靠數(shù)據(jù)。

1.2.2 蒜汁對B.subtilis芽孢形成[5]影響

分別將菌懸液配成106cfu?mL-1和104cfu?mL-1兩個(gè)稀釋度作對比試驗(yàn),按接種量0.5%接入液體培養(yǎng)基培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液中細(xì)菌處在對數(shù)生長期(11 h)時(shí),將大蒜原汁按不同濃度加入到培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)不同時(shí)間,取出后立即在80℃條件下加熱10 min,殺死營養(yǎng)細(xì)胞,再進(jìn)行梯度稀釋,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[6]。

1.2.3 蒜汁對2,6-吡啶二羧酸(DPA)的影響

取試驗(yàn)1.2.2中經(jīng)過大蒜汁處理的菌懸液混合液(106cfu?mL-1稀釋度)5 mL,立即離心(3000 r?min-1)30 min分離菌體,加5 mL無菌水,在 121 ℃加熱30 min,冷卻后加入1 mol?L-1醋酸0.1 mL,室溫下靜置1 h,再離心(3000 r?min-1)30 min,往4 mL上清液中加1 mL的DPA色測反應(yīng)劑,于440 nm下測定其OD值[3]。

1.2.4 蒜汁濃度對B.subtilis芽孢發(fā)芽[5]的影響

取制備好的芽孢懸液[7](104cfu?mL-1)一定量,于80℃加熱10 min熱激活芽孢后,迅速冰水冷卻,在不同發(fā)芽時(shí)間與不同濃度大蒜汁中孵化30 min,梯度稀釋后,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[6]。

1.2.5 蒜汁處理B.subtilis的時(shí)間對其芽孢發(fā)芽[5]的影響

用試驗(yàn)1.2.4的方法將芽孢熱激活后,迅速冰水冷卻,在不同發(fā)芽時(shí)間與濃度為1%的大蒜汁處理不同時(shí)間,用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[6]。

2 結(jié)果和分析

2.1 枯草芽孢桿菌的顯微鏡鏡檢結(jié)果

通過對比開始形成芽孢時(shí)期和芽孢發(fā)芽后的鏡檢圖(圖1和圖2),確定培養(yǎng)枯草芽孢桿菌11 h時(shí),是芽孢形成的開始時(shí)期。

將制備好的芽孢懸液進(jìn)行芽孢染色鏡檢,以確定芽孢懸液中無營養(yǎng)細(xì)胞,鏡檢結(jié)果見圖3。鏡檢結(jié)果表明制備的芽孢懸液已無營養(yǎng)細(xì)胞,可用于芽孢發(fā)芽的試驗(yàn)。

圖1 開始形成芽孢時(shí)期的鏡檢圖(11 h)Fig.1 Micrograph of beginning sporulation(11 h)

圖2 芽孢形成后的鏡檢圖(15 h)Fig.2 Micrograph of sporulation(15 h)

圖3 芽孢懸液鏡檢圖Fig.3 Micrograph of spore suspension

2.2 蒜汁對B.subtilis芽孢形成的影響

從圖4可以看出,當(dāng)蒜汁濃度為1%,菌懸液濃度為104cfu?mL-1時(shí),其抑制時(shí)間持續(xù)到48 h時(shí)仍有一定的抑制性,平板菌落數(shù)與空白對照相差10倍。從圖5中可以看出,當(dāng)菌懸液濃度為106cfu?mL-1時(shí)的各大蒜汁處理液與菌作用時(shí)間超過24 h后,這種抑制作用消失,結(jié)果都與空白一致。綜合分析可知,大蒜汁對枯草桿菌的芽孢形成有重要影響作用。在大蒜汁與菌作用時(shí)間相對較短時(shí),大蒜汁濃度越高,芽孢形成的數(shù)量越少,其抑制芽孢形成的時(shí)間越長。

圖4 蒜汁對芽孢形成的影響/104cfu?mL-1Fig.4 Effectofsporulation on sensitivity of B.subtilis to garlic juice

圖5 蒜汁對芽孢形成的影響/106cfu?mL-1Fig.5 Effectofsporulation on sensitivity of B.subtilis to garlic juice

2.3 蒜汁對2,6-吡啶二羧酸(DPA)的影響

DPA是芽孢中的一種重要物質(zhì),在芽孢形成的后期才合成,其含量一定,很少隨培養(yǎng)條件的變化而變化[8],故可通過DPA濃度的變化間接衡量成熟芽孢數(shù)量的多少。從圖6試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)大蒜汁處理過的枯草芽孢桿菌中芽孢所含DPA量的變化趨勢比空白對照晚12 h。綜上分析,大蒜汁對枯草芽孢桿菌的芽孢形成影響主要是延緩了芽孢的形成過程。這也很好的解釋了結(jié)果與分析中2.2的結(jié)論。

圖6 DPA含量的測定Fig.6 Determination of quantification of DPA

2.4 蒜汁濃度對B.subtilis芽孢發(fā)芽的影響

結(jié)果如表 1所示,將處理后的混合液取0.1 mL涂平板發(fā)現(xiàn),活菌菌落數(shù)與對照相當(dāng),沒有差異性。在芽孢發(fā)芽的120 min內(nèi),濃度高達(dá)10%的大蒜汁都對芽孢發(fā)芽沒有顯著性影響。

表1 蒜汁濃度、發(fā)芽時(shí)間對芽孢發(fā)芽的影響Table 1 The number of CFU at different germination time and concentrations of garlic juice

2.5 蒜汁處理B.subtilis的時(shí)間對其芽孢發(fā)芽的影響

結(jié)果如表2所示,在芽孢發(fā)芽的120 min內(nèi),處理時(shí)間長達(dá)120 min都對芽孢發(fā)芽沒有任何影響,將處理后的混合液取0.1 mL涂平板發(fā)現(xiàn),活菌菌落數(shù)與對照相當(dāng),沒有差異性。

通過考察不同蒜汁濃度、不同發(fā)芽時(shí)間、不同抑制處理時(shí)間三個(gè)因素之間的二因素試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)這三個(gè)因素都對芽孢的發(fā)芽沒有影響,試驗(yàn)結(jié)果與空白對照相比無顯著性差異,說明大蒜汁并不影響芽孢的發(fā)芽。

表2 處理時(shí)間、發(fā)芽時(shí)間對芽孢發(fā)芽的影響Table 2 The number of CFU at different treatment time and germination time with concentration of garlic juice

3 結(jié)論與討論

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),大蒜汁對B.subtilis芽孢和DPA的形成有重要作用,其影響主要是延緩了芽孢的形成過程,且隨著大蒜汁濃度的增加,對形成芽孢的影響也越大,其抑制芽孢形成的時(shí)間越長。大蒜汁對芽孢的發(fā)芽影響作用不大,反應(yīng)時(shí)間長達(dá)2 h,濃度高達(dá)10%的大蒜汁對芽孢的發(fā)芽沒有顯著影響。這可能是由于大蒜所含有效成分的硫原子與細(xì)菌生長繁殖所必需的半胱氨酸分子中的巰基相結(jié)合而抑制其生長和繁殖,其作用機(jī)制是與影響半胱氨酸蛋白酶活性的幾種酶如脫氫酶、硫氧還蛋白還原酶、RNA聚合酶等上面的巰基結(jié)合,抑制了其活性[9]。芽孢形成的過程中,特別是在芽孢衣層形成外衣時(shí),芽孢中半胱氨酸顯著增加。半胱氨酸是由谷胱苷肽在水解酶活性增強(qiáng)作用下水解而來的[10],這對芽孢外衣形成是必需的;由于合成半胱氨酸受阻,從而可能改變了細(xì)菌細(xì)胞乃至芽孢的通透性,導(dǎo)致細(xì)菌芽孢壁層結(jié)構(gòu)的不完整,這也解釋了大蒜汁對形成芽孢的影響試驗(yàn);而芽孢發(fā)芽的過程非常短,熱激活后芽孢衣中半胱氨酸已經(jīng)變性,芽孢透性增加,開始自然裂解和下一代營養(yǎng)細(xì)胞的生長,此時(shí)加入大蒜汁處理2 h內(nèi),大蒜汁無作用效果。關(guān)于此現(xiàn)象原因并未在國內(nèi)外報(bào)道中發(fā)現(xiàn),有待于進(jìn)一步研究。此外,大蒜對于芽孢的作用機(jī)理目前并無統(tǒng)一認(rèn)識,也有待于進(jìn)一步研究。

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