吳仕平，陳明

糖尿病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)等危癥［1］。糖尿病大血管病變是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)遠期并發(fā)癥和主要死亡原因。血管內皮損傷已經公認為糖尿病患者動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)［2］，尋找血管內皮損傷的治療措施，在心血管疾病的防治上將起著重要作用。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)對動脈粥樣硬化的防治作用是近年來的研究熱點。替米沙坦結構獨特，除阻斷血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1)外，還可使過氧化物酶體增殖物活化受體γ(Peroxisome Proliferator-activated receptor γ，PPARγ)激活［3］，在動脈粥樣硬化的防治方面，可能有其“獨特”作用。本實驗用替米沙坦干預糖尿病大鼠，觀察其對血管內皮細胞形態(tài)、功能的影響，探討其防治血管內皮損傷的可能機制，為臨床更好地防治糖尿病及其大血管病變提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠由重慶醫(yī)科大學動物中心提供，鏈脲佐菌素購自sigma公司，替米沙坦由勃林格殷格翰公司惠贈，總膽固醇(TC)測定試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定試劑盒購自柏定生物工程(北京)有限公司，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒購自浙江東甌生物工程有限公司，甘油三脂(TG)測定試劑盒購自北京中衫金橋技術生物有限公司，過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒以及一氧化氮(NO)測定試劑盒南京建成生物工程研究所，葡萄糖(Glu)測定試劑盒購自上海榮盛生物技術有限公司，Hitachi-7500透射電鏡(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型 采用實驗性T2DM大鼠模型的建立方法:雄性SD大鼠喂以高脂、高糖飼料。4周后，大鼠禁食12 h，以低劑量鏈脲佐菌素(STZ:30 mg/kg，臨用時溶于 pH4.5、濃度0.1 mmol/L 的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液中)單次腹腔注射，72 h后，斷尾采血測血糖值，以血糖高于16.7 mmol/L作為糖尿病成模標準。

1.2.2 分組及干預 30只大鼠分為3組:正常對照組(n=10)、糖尿病對照組、(n=10)，替米沙坦組(n=10)，藥物經灌飼法喂給，替米沙坦組給予替米沙坦6.5 mg/(kg.d)灌飼，正常對照組及糖尿病對照組給予等量蒸餾水模擬灌飼，干預時間為8周。

1.2.3 動物血壓測定 采用尾部套囊血壓分析器測量大鼠收縮壓:將清醒狀態(tài)大鼠置于38℃恒溫箱中預熱10 min，然后將大鼠固定于測量箱中，待其安靜后以RBP-1型大鼠尾動脈血壓計測量大鼠尾部收縮壓。

1.2.4 標本采集 干預結束后，用3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，開胸取血處死大鼠，離心、分離血清，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩Ｕ≈鲃用}，各組隨機選取一個標本立即放入2%戊二醛溶液中固定，送電鏡室作透射電鏡檢查。

1.2.5 指標的檢測 血清Glu測定采用葡萄糖氧化酶法，TC測定采用 CHOD-PAP法，TG測定采用GPO-PAP法，HDL-C測定采用直接法，LDL-C測定采用PVS沉淀法，血清一氧化氮(NO)測定采用硝酸還原酶法，CAT測定采用可見光法，MDA測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。在Hitachi-7500透射電鏡下觀察血管內皮細胞的形態(tài)。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件處理，數據以均數±標準差(±s)表示，多組間差異采用方差分析，組間比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血壓、血糖的比較 8周后，與正常對照組比較，糖尿病對照組血壓和血糖均較正常組明顯升高(P＜0.01);與糖尿病對照組比較，替米沙坦組收縮壓和血糖均降低(P＜0.01)(表1)。

2.2 血脂的比較 干預8周后，與正常對照組比較，糖尿病對照組TC、TG、LDL-C均顯著高于正常對照組而HDL-C則明顯低于正常對照組(P＜0.01);與糖尿病對照組比較，替米沙坦組TC、TG、LDL-C顯著降低、HDL-C 顯著升高(P ＜0.05或0.01)(表1)。

2.3 過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)的比較 干預8周后，與正常對照組比較，糖尿病對照組CAT明顯低于正常對照組(P＜0.01)，而MDA則顯著高于正常組(P＜0.01);與糖尿病對照組比較，替米沙坦組CAT明顯升高而MDA則顯著降低(P均＜0.01)(表2)。

2.4 血清一氧化氮(NO)含量的比較 干預8周后，與正常對照組比較，糖尿病對照組大鼠血清NO水平明顯低于正常對照組(P＜0.01);與糖尿病對照組比較，替米沙坦組血清NO水平顯著升高(P＜0.05)(表2)。

表1 三組大鼠收縮壓、血糖和血脂水平(±s)

表1 三組大鼠收縮壓、血糖和血脂水平(±s)

注:SBP:收縮壓;Glu:血糖;TC:總膽固醇;TG:甘油三酯;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;與正常對照組比較，aP ＜0.01，bP ＜0.05;與糖尿病對照組比較，cP ＜0.01，dP ＜0.05;1 mm Hg=0.133 kPa

項目 正常對照組(n=10)糖尿病對照組(n=10)替米沙坦組(n=10)SBP(mm Hg) 112.25 ±7.06 136.38 ±10.13a108.18 ±7.10c Glu(mmol/L) 6.45 ±1.17 23.11 ±3.67a18.92 ±3.49ac TC(mmol/L) 1.93 ±0.50 2.69 ±0.49a 2.22 ±0.42d TG(mmol/L) 1.46 ±0.52 1.95 ±0.20a 1.57 ±0.27d LDL-C(mmol/L) 0.49 ±0.21 1.74 ±0.39a 1.26 ±0.24ac HDL-C(mmol/L) 1.20 ±0.41 0.57 ±0.24a 0.83 ±0.21b

表2 三組大鼠血清CAT、MDA和NO的水平(±s)

表2 三組大鼠血清CAT、MDA和NO的水平(±s)

注:CAT:過氧化氫酶;MDA:丙二醛;NO:一氧化氮;與正常對照組比較，aP ﹤0.01;與糖尿病對照組比較，cP ＜0.01，dP ＜0.05

項目 正常對照組(n=10)糖尿病對照組(n=10)替米沙坦組(n=10)CAT(u/mL) 28.52 ±6.19 8.16 ±1.20a 20.85 ±4.81ac MDA(nmol/L) 8.59 ±1.32 17.32 ±1.10a 13.22 ±1.54ac NO(umol/L) 76.52 ±8.34 51.60 ±3.63a 57.67 ±5.80ad

2.5 透射電鏡下血管內皮細胞形態(tài)學表現 正常對照組形態(tài):內皮細胞及平滑肌細胞形態(tài)完全正常(圖1A)。糖尿病對照組形態(tài):內皮細胞腫脹、壞死、脫落，內質網擴張，細胞核凝固、異染色質邊集，內彈力膜斷裂。平滑肌細胞形態(tài)基本正常，無增殖及遷移現象(圖1B)。替米沙坦組形態(tài):內皮細胞尚完整，細胞下水腫，與內彈力膜之間形成剝離現象，但內彈力膜無斷裂。平滑肌細胞形態(tài)正常(圖1C)。

3 討論

糖尿病發(fā)病率逐年增加，第17屆國際糖尿病大會報道，全球已確診糖尿病患者1.5億人，預測2025年將增至3億。其中T2DM占糖尿病發(fā)病率的90%～95%［4］，血管內皮損傷已經公認為糖尿病患者動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)［5-6］，本研究結果顯示，與正常對照組相比，糖尿病對照組大鼠血管內皮細胞出現腫脹、壞死、異染色質邊集、內彈力膜斷裂等電鏡下形態(tài)學改變，反映內皮細胞功能的重要指標血清NO水平也較正常組明顯降低，血管內皮細胞結構、功能都發(fā)生了損傷性改變，與既往研究相符。

ARB對動脈粥樣硬化的防治作用是最近的研究熱點。越來越多的證據表明PPAR-γ激動劑對血管壁細胞具有抗炎、抗氧化、抗增殖作用，從而降低動脈粥樣硬化的風險［7-8］。而替米沙坦是目前常規(guī)口服劑量下能使PPARγ真正激活的唯一的ARB。本實驗用替米沙坦干預糖尿病大鼠，觀察它對糖尿病大鼠血管內皮細胞形態(tài)、功能的影響，結果發(fā)現替米沙坦能降低糖尿病大鼠的血壓、血糖水平，改善血脂代謝紊亂，發(fā)揮抗氧化作用，電鏡下血管內皮細胞的形態(tài)較糖尿病組明顯改善，血清NO水平也較糖尿病組明顯升高，使糖尿病所造成的血管內皮細胞的形態(tài)、功能損傷都起到了一定程度的恢復。實驗結果顯示替米沙坦對糖尿病導致的血管內皮損傷有一定防治作用，同時也證實了其對糖尿病早期動脈粥樣硬化的防治作用。

ARB的心血管保護作用已經得到共識，替米沙坦作為獨特的ARB能否發(fā)揮其獨特的作用一直是科研和臨床工作者的興趣點，Yamagishi等［9］認為替米沙坦將成為既針對高血壓患者的糖尿病又針對其心血管病變的有希望的“心臟代謝沙坦”。通過動物實驗證實了替米沙坦對糖尿病血管內皮損傷的防治作用，為臨床更好地防治糖尿病早期動脈粥樣硬化提供了確實的實驗依據。

圖1 透射電鏡下各組血管內皮細胞形態(tài)學表現 A:正常對照組B:糖尿病對照組C:替米沙坦組

［1］ National Institutes of Health.Third report of the national cholesterol education program(NCEP)expert panel on detection，evaluation，and treatment of High blood cholesterolin adults(adult treatment panelⅢ)final report.NIH 2001.

［2］ Nakagami H，Morishita R，Yamamoto K，et al.Hepatocyte growth factor prevents endothelial cell death through inhibition of bax translocation from cytosol to mitochondrial membrane［J］.Diabetes，2002，51(8):2604-2611.

［3］ Benson，Stephen C，Pershadsingh，et al.Identification of Telmisartan as a Unique AngiotensinII Receptor Antagonist With Selective PPAR［gamma］-Modulating Activity［J］.Hypertension，2004，43(5):993-1002.

［4］第十七屆國際糖尿病大會簡介［J］.中華糖尿病雜志，2001，9(1):60-62.

［5］ Hsueh WA，Lyon CJ，Quinones MJ.Insulin resistance and the endothelium［J］.Am J Med，2004，117(2):109-117.

［6］ Morishita，Ryuichi，Nakamura，et al.Potential Role of an Endothelium-Specific Growth Factor，Hepatocyte Growth Factor，on Endothelial Damage in Diabetes［J］.Diabetes，1997，46(1):138-142.

［7］ Desvergne B，Upanberg A，Devchand PR，et al.The peroxisome proliferator-activated receptors at the cross-road of diet and hormonal signaling［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，1998，65(1-6):65-74.

［8］李敏，吳學思.替米沙坦改善糖脂代謝的研究進展［J］.中國醫(yī)藥，2010，5(1):90-91.

［9］ Yamagishi S，Takeuchi M.Telmisartan is a promising cardiometabolic sartan due to its unique PPAR-gamma-inducing property［J］.Med Hypotheses，2005，64(3):476-478.