呂 舟

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林 132000）

牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲(chóng)（Theileria.sergenti）寄生于牛體內(nèi)引起的以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫大為主要臨床癥狀的一種血液原蟲(chóng)病[1－2]。該病呈世界性分布，我國(guó)東北、西北、華北、華南等地區(qū)牛瑟氏泰勒蟲(chóng)感染情況較嚴(yán)重[3－7]。近年來(lái)，隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)勢(shì)尤其是引進(jìn)牛和改良牛的發(fā)病率和致死率均較高，已成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。

硬蜱（Ixoaldae）是家畜多種傳染病和寄生蟲(chóng)病的傳播者，特別對(duì)家畜血孢子蟲(chóng)病病原的傳播起著重要作用[8]。該蟲(chóng)體寄生于牛、羊體表，吸食血液，引起家畜消瘦，更為嚴(yán)重的是，蜱是焦蟲(chóng)病、立克次氏體病等的傳播者[9]。其中硬蜱隸屬硬蜱科血蜱屬的長(zhǎng)角血蜱為牛瑟氏泰勒蟲(chóng)的傳播媒介[10]。通過(guò)叮咬，將病牛的感染紅細(xì)胞吸入，經(jīng)蜱體內(nèi)發(fā)育，再叮咬時(shí)，將正在分裂的焦蟲(chóng)注人另一宿主（病牛）體內(nèi)，并繼續(xù)吸入感染的紅細(xì)胞[11]。針對(duì)蜱這一傳播媒介，本試驗(yàn)對(duì)其DNA含量進(jìn)行了分析，比較其與牛瑟氏泰勒蟲(chóng)基因組DNA含量及P33表面蛋白基因同源性，進(jìn)一步證明其傳播途徑及確定含量關(guān)系，為焦蟲(chóng)病、立克次氏體病等病基因組DNA的提取提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病料及主要試劑

在牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病的高峰期6～7月，于吉林省延邊州琿春市某牧場(chǎng)采集樣本。?？鼓杭拔篁鐚?duì)應(yīng)在同一頭牛身上被采集，每頭做標(biāo)記。DNA提取試劑盒、exTaq酶等均購(gòu)自TaKaRa公司，其他試劑為分析純。

1.2 涂片的制備

取血液樣本涂片、自然干燥，滴加甲醇2～3滴，固定2～3min。將固定片浸于盛有姬姆薩染色液的染缸中染30min，然后水洗、干燥、顯微鏡觀察。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

據(jù)GenBank（AF521557.1）上發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲(chóng)P33表面蛋白基因序列，應(yīng)用Primer 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：P1：5－atgttgtccaagaaatcgtt－3′ ，P2：5－cagtattctactatctctag－3 ′，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為852 bp。

1.4 牛瑟氏泰勒蟲(chóng)基因組DNA的提取及目的片段擴(kuò)增

用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以其為模板，采用25μL PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL， dNTP 2μL，P1、P2引物各1μL，模板DNA 2 μL，exTaq酶 0.25 μL，dH2O 16.25 μL。PCR反應(yīng)條件為35個(gè)循環(huán)，94℃預(yù)變性5min，94℃ 45 s，55℃ 1min，72℃ 1min，72℃ 延伸10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 紫外分光光度計(jì)法測(cè)DNA含量

將樣品進(jìn)行50倍稀釋后，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)為260及280 nm下調(diào)零，并測(cè)定其OD值，依據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算其DNA濃度含量。

計(jì)算公式見(jiàn)式（1）

注：濃度單位為μg·mL－1。

1.6 同源性比較

將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，通過(guò)軟件DNAMAN，對(duì)GenBank上登錄的基因序列與牛瑟氏泰勒蟲(chóng)延邊州分離株的兩個(gè)樣本的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1 涂片鏡檢的結(jié)果

涂片鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 姬姆薩染色涂片鏡檢結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，鏡檢發(fā)現(xiàn)兩種血液樣本中紅細(xì)胞形狀大小不一，紅細(xì)胞內(nèi)有小型蟲(chóng)體，呈梨籽形和逗點(diǎn)形等形狀，A圖中蟲(chóng)體的染蟲(chóng)率約為15%，B圖蟲(chóng)體的染蟲(chóng)率約為4%?？梢?jiàn)蜱吸血后血液中牛瑟斯泰勒蟲(chóng)明顯高于牛血液中染蟲(chóng)率。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以兩種牛瑟氏泰勒蟲(chóng)基因組DNA為模板，P1、P2為引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，在852 bp擴(kuò)增出特異性條帶，并可明顯看出蜱吸血后血液擴(kuò)增條帶比牛血液擴(kuò)增條帶清楚得多。與預(yù)期結(jié)果相一致。

圖2 PCR鑒定結(jié)果

2.3 紫外分光光度計(jì)法測(cè)DNA含量

透過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量后，經(jīng)公式計(jì)算，結(jié)果在蜱吸血后血液DNA濃度為127 ug·mL－1，而牛血液中DNA濃度僅為52 ug·mL－1。結(jié)果顯示蜱吸血后血液DNA濃度明顯高于血液中DNA濃度。

2.4 同源性比較

測(cè)序結(jié)果表明，牛血液中和蜱吸血后血液中該基因序列同源性為100%。兩者與GenBank上已發(fā)表的序列同源性為99%，由此可見(jiàn)該基因在蜱吸血后血液中和牛血液中具有相同的序列，進(jìn)一步證明蜱是牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病的傳播媒介。

3 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和牛只的頻繁運(yùn)輸，瑟氏泰勒蟲(chóng)病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)，且疫區(qū)發(fā)病率和致死率均較高，給畜牧業(yè)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注。因此對(duì)瑟氏泰勒蟲(chóng)病的研究已迫在眉睫。蜱是瑟氏泰勒蟲(chóng)是傳播媒介，已知能傳播瑟氏泰勒蟲(chóng)蜱有長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalis longicornis）、嗜群血蜱（H.concinna）和日本血蜱（H.japonica）3種，我國(guó)主要是長(zhǎng)角血蜱。

DNA是主要的遺傳物質(zhì)，而遺傳物質(zhì)的基本功能是遺傳信息的傳遞和表達(dá)，所以對(duì)DNA的來(lái)源及含量的測(cè)定有著極其重要的意義。本試驗(yàn)通過(guò)DNA試劑盒在牛血液中和蜱吸血后血液中分別提取出基因組DNA，通過(guò)DNA試劑盒法替代傳統(tǒng)的乙醇沉淀法提取基因組DNA，可得到高質(zhì)量的不含苯酚、氯仿、乙醇等化學(xué)試劑的基因組DNA，并盡可能避免在傳統(tǒng)乙醇沉淀過(guò)程中因DNA沉淀不完全而導(dǎo)致的DNA損耗，獲取最大量的基因組DNA。

通過(guò)姬姆薩染色法、PCR鑒定、紫外分光光度計(jì)法可初步判定蜱吸血后血液中基因組DNA要明顯高于牛血液。測(cè)序結(jié)果表明，牛血液中和蜱吸血后血液中該基因序列同源性為100%。兩者所得序列經(jīng)BLAST對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的牛瑟氏泰勒蟲(chóng)P33主要表面蛋白基因序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果為99.0%，這表明所擴(kuò)增產(chǎn)物是P33蛋白基因序列，與預(yù)期結(jié)果相符。進(jìn)一步證明蜱是牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病的傳播媒介。為今后牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病的研究及對(duì)蜱這一傳播媒介的深入探討提供理論依據(jù)。

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