王 卓，盧玉婷，魏 雪，張海斌，柯玉花，苗麗娟

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101）

豬圓環(huán)病毒（PCV）是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒?，F(xiàn)已知PCV有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2。PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒。PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原，并多發(fā)于5～16周齡的豬。該病最早發(fā)現(xiàn)于加拿大，很快在歐美及亞洲一些國(guó)家包括我國(guó)發(fā)生和流行，除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征（PDNS）、增生性壞死性肺炎（PNP）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病亦與PCV2感染有重要關(guān)聯(lián)。PCV2及其相關(guān)的豬病，死亡率達(dá)10%～30%，較嚴(yán)重的豬場(chǎng)在暴發(fā)本病時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)已被世界各國(guó)的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）之后新發(fā)現(xiàn)的引起豬攻毒障礙的重要傳染病。

本試驗(yàn)利用制備好的原核表達(dá)的PCV2 Cap蛋白，免疫Balb/c鼠，制備Ⅱ型豬圓環(huán)病毒Cap蛋白的多克隆抗體，根據(jù)其抗體產(chǎn)生情況分析其抗體產(chǎn)生規(guī)律，生產(chǎn)出的多抗可以作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，且在制備多抗過(guò)程中檢測(cè)出抗體產(chǎn)生的規(guī)律，為制備圓環(huán)病毒的單克隆免疫程序奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

PCV2 Cap蛋白由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。蒸餾水、弗氏佐劑、PBS為國(guó)產(chǎn)試劑。雌性Balb/c鼠購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

將雌性Balb/c鼠6只隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組3只。第1次免疫將定量的純化好的PCV2 Cap蛋白與等體積的完全弗氏佐劑混合并完全乳化后，小鼠腹腔注射0.5mL·只-1；間隔15 d進(jìn)行第2次免疫，佐劑用弗氏不完全佐劑，免疫方法和劑量同上；再間隔15 d后進(jìn)行第3次免疫，佐劑用弗氏不完全佐劑，免疫方法和劑量同上。每次免疫后第3、7、10天采血，第3次免后的第10天采取小鼠眼球采血。對(duì)照組采用PBS免疫，免疫方法和劑量同免疫組。

1.2.2 抗血清制備方法

采取小鼠尾部或眼球血液，37℃1 h，4℃過(guò)夜，1 500 rpm離心5min，吸取上層血清，-80℃分裝保存。

1.2.3 間接ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)

采用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)，以純化出的Cap蛋白為抗原，檢測(cè)制備出的多克隆抗體效價(jià)，純化后的融合蛋白按200 ng·孔-1包被酶標(biāo)板，以對(duì)照組血清為陰性對(duì)照，將免疫血清和陰性血清同時(shí)作1∶100稀釋后，用間接ELISA檢測(cè)抗體OD值，具體步驟如下。將最后一次眼球采血中的待檢血清按照1∶100、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800及1∶25 600稀釋后，用間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。

每孔加入100μL以碳酸鹽緩沖液稀釋的Cap蛋白抗原（終濃度為2μg·mL-1）包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，PBST洗3次后進(jìn)行封閉；每孔加封閉液100μL（5%脫脂乳），37℃放置1 h后，PBST洗3次；每孔加100μL以PBST梯度稀釋的被檢血清，37℃放置1 h，PBST洗3次；每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（1∶5 000稀釋）100μL，37℃放置1 h，PBST洗3次；每孔加入新配制的OPD顯色溶液100μL，置暗盒中10～20min后，每孔加入50 μL終止液（2mol·L-1H2SO4）終止反應(yīng)。

1.2.4 結(jié)果判定

將96孔酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀492 nm處，測(cè)定每孔的OD值，結(jié)果以P/N≥2.1判定為陽(yáng)性。

1.2.5 多克隆抗體的鑒定

將純化的PCV2 Cap蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，經(jīng)BG-trans BLOT迷你轉(zhuǎn)移芯濕轉(zhuǎn)2 h，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜。PBST洗5次，用添加0.1%～0.2%的Tween-20封閉液1:100稀釋制備的鼠血清和陰性血清，37℃2 h。PBST洗5次，浸入含0.1%～0.2%的Tween-20封閉液1∶5 000稀釋的紅外染料標(biāo)記羊抗鼠熒光二抗（避光），37℃放置1 h，PBST洗滌 5次（避光），用PBS再洗滌2次去膜上殘留的Tween-20（避光），用Odyssey紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 抗體檢測(cè)結(jié)果

抗體檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 抗體檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，第1次免疫后第3、7、10天采血的3只老鼠的抗體陽(yáng)性與陰性比值（P/N）是分別為1.5、1.8、2.1，1.9、1.6、2.1，1.6、1.7、2.1；第2次免疫后第3、7、10天采血的3只老鼠的抗體P/N是 2.3、2.9、3.7，2.3、2.7、3.6，2.3、2.8、3.6；第3次免疫后第3、7、10天采血3只老鼠的抗體P/N 為 3.9、 4.6、 4.6， 3.4、 4.7、 4.9， 3.6、 4.6、4.7。結(jié)果表明，在第1次免疫后第10天的抗體P/N≥2.1，說(shuō)明第1次免疫后第10天的血清可以作為陽(yáng)性血清。

2.2 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 不同血清稀釋倍數(shù)的多克隆抗體效價(jià)

由表2可知，小鼠最后采血測(cè)定其血清效價(jià)，結(jié)果表明，其抗體效價(jià)為1∶12 800（P/N＞2.1）。

2.3 抗體產(chǎn)生規(guī)律

小鼠第1次免疫后10 d開始產(chǎn)生抗體P/N＞2.1，第2次免疫后抗體水平明顯升高，第3次免疫第7～10天后抗體水平基本不變。

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot檢測(cè)結(jié)果見附圖。

附圖 應(yīng)用純化的蛋白對(duì)多抗進(jìn)行鑒定的結(jié)果

由附圖可知，在26kDa附近出現(xiàn)單一的條帶，說(shuō)明制備的鼠多抗是目的蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體。

3 討論

抗原和抗體是免疫學(xué)檢驗(yàn)的兩大重要因素，也是整個(gè)免疫反應(yīng)的基本條件?？贵w是機(jī)體在抗原刺激下所產(chǎn)生的特異性球蛋白。特異性抗體是免疫應(yīng)答中的重要產(chǎn)物，也是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的試劑，對(duì)于抗原的分析鑒定和定量檢測(cè)極為重要，在各種免疫學(xué)診斷中應(yīng)用極為廣泛。

目前人工制備的特異性抗體分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體。單克隆抗體用雜交瘤技術(shù)制備，近年來(lái)又出現(xiàn)了基因工程抗體（單鏈抗體），多克隆抗體存在于免疫動(dòng)物抗血清中[1]。前者生產(chǎn)成本高、周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高，故本研究選擇制備多克隆抗體，更主要是為單克隆抗體制備的免疫程序奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

制備高效價(jià)、高特異性的免疫血清必須有理想的免疫原、挑選適合的動(dòng)物。蛋白質(zhì)是良好的抗原，本實(shí)驗(yàn)制備的PCV2 Cap融合蛋白已經(jīng)親和層析法純化，達(dá)到7.29mg·mL-1可作為免疫原免疫小鼠，制備抗血清[2-3]。

4 小 結(jié)

本試驗(yàn)制備的Ⅱ型豬圓環(huán)病毒Cap蛋白多克隆抗體效價(jià)達(dá)到1∶12 800，制備的抗體產(chǎn)生規(guī)律是第1次免疫小鼠后第10天開始產(chǎn)生陽(yáng)性抗體，第2次免疫后抗體水平明顯升高，第3次免疫后第7～10天抗體水平基本保持不變。

[1]苗麗娟.豬圓環(huán)病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].飼料博覽,2011（2）:49-51.

[2]苗麗娟,符芳,王小武,等.豬圓環(huán)病毒2型去核定位信號(hào)ORF2基因的原核表達(dá)與初步應(yīng)用[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008（5）:26-29.

[3]應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制豬圓環(huán)病毒2型的復(fù)制和表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的桿狀病毒的免疫保護(hù)作用[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2008.