斷奶仔豬對(duì)毒力基因缺失大腸桿菌的免疫應(yīng)答

胡文霞，馮瑜菲，何麗麗，關(guān)瑋琨，江馗語(yǔ)，師東方

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

豬水腫病(Eedema disease of swine，ED)是由某些特定血清型產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌(STEC)引起的斷奶仔豬的一種急性致死性傳染病[1]，以眼瞼、胃壁等處水腫、共濟(jì)失調(diào)、驚厥和麻痹為特征[2]。研究表明，F(xiàn)18ab菌毛和志賀樣毒素Ⅱ型變異體(Shigalike toxinⅡ variant，SLT-Ⅱe)是豬 ED大腸桿菌主要毒力因子[3]，致病菌以其菌毛粘附于豬小腸上皮細(xì)胞，在腸道內(nèi)定居和增殖并產(chǎn)生SLT-Ⅱe侵入機(jī)體，導(dǎo)致感染豬出現(xiàn)水腫和神經(jīng)癥狀[4]。

目前，應(yīng)用滅活疫苗對(duì)仔豬進(jìn)行免疫是預(yù)防該病的主要措施，但免疫效果并不理想，這可能與滅活疫苗在制備過(guò)程中造成抗原破壞或有效抗原量不足有關(guān)，而且不能發(fā)揮腸道黏膜免疫系統(tǒng)在抗感染過(guò)程中的免疫保護(hù)作用[5]。楊春柳等用SLT-Ⅱe編碼基因突變菌株(O139/SLT-Ⅱe*/07)口服免疫小鼠，證實(shí)該基因突變菌株對(duì)小鼠安全，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生局部免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，顯示出了該菌株作為口服疫苗的潛在價(jià)值[6]。本實(shí)驗(yàn)用該突變菌免疫斷奶仔豬，為豬水腫病口服疫苗的研究提供更加直接的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 豬ED大腸桿菌(C83684，O139；CMCC44498，O138)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬ED大腸桿菌基因突變菌株(O139/SLT-Ⅱe*/07)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[7]；斷奶仔豬購(gòu)自哈爾濱郊區(qū)某豬場(chǎng)；HRP標(biāo)記的兔抗豬IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Affinity Purified Coat anti-Pig IgA購(gòu)自哈爾濱歐瑞德生物試劑公司；CaCl2和海藻酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；LB培養(yǎng)基購(gòu)自全氏金生物有限公司；豬細(xì)胞因子IL-10、IL-4、INF-γ的ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 微膠囊的制備 取在LB培養(yǎng)基中活化至第3代的 O139/SLT-Ⅱe*/07 按 1∶1000接種 1000 mL LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)18 h，離心收集菌體(4000 r/min，15 min，4℃)，用2%無(wú)菌海藻酸鈉重懸。將重懸物均勻滴入2%CaCl2溶液中固化 40 min，制備的微膠囊用。生理鹽水清洗之后4℃無(wú)菌貯存[8-10]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、免疫和檢測(cè)樣品采集 將35日齡健康斷奶仔豬隨機(jī)分成3組，每組3頭，隔離飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)1組口服包有突變菌株的微膠囊(6.27×1013cfu)[4]；實(shí)驗(yàn)2組口服突變菌株的菌液(6.27×1013cfu)；實(shí)驗(yàn)3組作為對(duì)照組，口服無(wú)菌的PBS。連續(xù)口服3 d，每天1次。分別于首免前、第3次免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d采集仔豬糞便、前腔靜脈血液并分離血清，于4℃保存，待檢。

1.4 豬血清中特異性IgG的檢測(cè) 將LB培養(yǎng)的無(wú)F18ab菌毛生長(zhǎng)的大腸桿菌O139以1×107cfu/mL包被ELISA反應(yīng)板；參照文獻(xiàn)[11]方法提取SLT-ⅡeB蛋白，以1.0 μg/mL包被反應(yīng)板；表達(dá)純化SLT-ⅡeA蛋白，以1.0 μg/mL包被反應(yīng)板；參照文獻(xiàn)[2]方法，用SB培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌O139，提取F18ab菌毛蛋白，以2.0 μg/mL包被反應(yīng)板。

參照文獻(xiàn)[6]用間接ELISA方法檢測(cè)血清中特異性IgG。以1∶80稀釋的各組豬血清樣品為一抗，1∶4000稀釋的HRP標(biāo)記兔抗豬IgG為二抗，常規(guī)操作，反應(yīng)終止后，測(cè)定OD450nm值。

1.5 豬糞便中特異性sIgA的測(cè)定 采用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。取各組豬的糞便樣品，每0.1 g糞便加入0.5 mL提取液，振蕩30 min，12000 r/min、離心10 min，收集上清液。

參照文獻(xiàn)[6]，分別以SLT-ⅡeA蛋白、SLT-ⅡeB蛋白、F18ab菌毛蛋白及LB培養(yǎng)的大腸桿菌O139為抗原包被ELISA反應(yīng)板，以糞便處理上清液為一抗，1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgA為二抗，常規(guī)操作，終止反應(yīng)后，測(cè)定OD450nm值。

1.6 豬血清中 IL-10、IL-4、INF-γ的測(cè)定 參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，取各組豬血清樣品檢測(cè)IL-10、IL-4、INF-γ的含量。

1.7 突變菌株的定植檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[6]，將采集的各組豬糞便樣品，用無(wú)菌生理鹽水稀釋后涂布于麥康凱(含萘啶酮酸50 μg/mL)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18 h。挑取萘啶酮酸抗性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，對(duì)陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行StuⅠ單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[12]的方法培養(yǎng)大腸桿菌O138，提取SLT-Ⅱe，-20℃保存?zhèn)溆?。分別從實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照組各隨機(jī)選擇1頭仔豬，耳靜脈注射SLT-Ⅱe純化蛋白6 ng/kg[12]，72 h內(nèi)觀察臨床癥狀，72 h后剖檢觀察組織器官的病理變化并制做組織切片[13]。

2 結(jié)果

2.1 豬血清中特異性IgG的檢測(cè) 經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，各組檢測(cè)數(shù)據(jù)取平均值(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)1組仔豬于第3次免疫后第21 d，在其血清中檢測(cè)到抗O139抗原的IgG抗體(P/N>2)(圖1A)；在免疫后第14 d、21 d、28 d檢測(cè)到抗F18ab菌毛蛋白的 IgG抗體(P/N>2)(圖1B)；在免疫后的第 7 d檢測(cè)到抗SLT-ⅡeA蛋白的 IgG抗體(P/N>2)(圖 1C)；針對(duì)SLT-ⅡeB蛋白相應(yīng)的IgG抗體水平變化不明顯(圖1D)。實(shí)驗(yàn)2組仔豬第3次免疫后21 d，血清中抗O139和SLT-ⅡeA的IgG抗體升高較明顯(圖1A和圖1C)，而針對(duì)其他抗原的抗體水平變化無(wú)顯著差異。

2.2 豬糞便中特異性sIgA的測(cè)定 經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè)，各組檢測(cè)數(shù)據(jù)取平均值(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)1組仔豬于免疫后第7 d、21 d、28 d，在其糞便中檢測(cè)到抗SLT-ⅡeA蛋白的sIgA抗體(P/N>2)(圖2A)；免疫后第14 d、21 d檢測(cè)到抗O139抗原的sIgA抗體(P/N>2)(圖2B)；免疫后第7 d檢測(cè)到抗SLT-ⅡeB蛋白的sIgA抗體(P/N>2)(圖2C)；免疫后第14 d檢測(cè)到抗F18ab菌毛蛋白的sIgA抗體(P/N>2)(圖2D)。實(shí)驗(yàn)2組仔豬免疫后，糞便中sIgA抗體也有升高，免疫后的第14 d、21 d檢測(cè)到了抗O139抗原的sIgA抗體(圖2B)；免疫后第 7 d、28 d檢測(cè)到抗SLT-ⅡeB蛋白的sIgA抗體(圖2C)；但sIgA抗體水平均低于實(shí)驗(yàn)1組，并且抗體持續(xù)時(shí)間比較短。

圖1 血清中特異性IgG抗體水平Fig.1 The level of specific IgG antibodies in serum

圖2 糞便中特異性sIgA抗體水平Fig.2 The level of specific sIgA in faeces

2.3 豬血清中IL-4、IL-10、INF-γ 的檢測(cè) 經(jīng)檢測(cè)，IL-4沒(méi)有明顯的變化(圖3A)；第3次免疫后14 d IL-10達(dá)最高值(354.65 pg/mL)，比免疫前(219.95 pg/mL)有明顯升高(圖3B)；INF-γ含量也有升高，但幅度沒(méi)有IL-10明顯，含量為58.146 pg/mL～75.762 pg/mL(圖 3C)。

圖3 血清中細(xì)胞因子水平Fig.3 The level of cytokines in serum

2.4 突變菌株的定植檢測(cè) 活性菌能否在腸道發(fā)揮作用，取決于能否在消化道環(huán)境中存活并定殖。只有在通過(guò)消化道后還保持大量活菌，并在腸道定殖，才能發(fā)揮生理作用[14]。第3次免疫后21 d，仍能從實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組豬的糞便樣品中檢出突變菌株，表明該突變菌株在豬的腸道內(nèi)發(fā)生了定植。

2.5 攻毒保護(hù)試驗(yàn)

2.5.1 臨床癥狀 攻毒后24 h內(nèi)仔豬均厭食、喜臥，24 h后實(shí)驗(yàn)1組仔豬恢復(fù)飲水，進(jìn)食。對(duì)照組仔豬萎靡不振、食欲消失，發(fā)熱達(dá)41℃，臥地不起，但眼瞼、頭部無(wú)明顯水腫表現(xiàn)和神經(jīng)癥狀。

2.5.2 病理組織學(xué)變化 攻毒72 h后迫殺，剖檢，可見(jiàn)對(duì)照組仔豬胃粘膜水腫、膽囊水腫、肝臟邊緣有壞死灶、肺臟呈纖維素樣病變；實(shí)驗(yàn)1組仔豬無(wú)可見(jiàn)病理變化。

對(duì)照組主要的病理組織學(xué)變化為漿液性變質(zhì)性肝炎、漿液性纖維素性肺炎、漿液性胃壁炎(H.E染色)。胃壁固有層結(jié)構(gòu)疏松，黏膜和肌層間有紅色膠樣水腫，黏膜下層增厚，黏膜下層結(jié)締組織水腫、出血(圖4A)。肺泡腔中可見(jiàn)脫落的泡壁上皮細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞。間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張，充滿(mǎn)紅細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、脫落，血管腔內(nèi)嗜中性白細(xì)胞聚積。間質(zhì)水腫，有嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4C)。

圖4 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組的組織切片(100×)Fig.4 Tissue section of control group and experimental groupⅠ(100×)

3 討論

腸道黏膜的局部免疫是動(dòng)物機(jī)體抵抗經(jīng)消化道感染病原的第一道屏障，能否誘導(dǎo)腸道黏膜的局部免疫對(duì)預(yù)防消化道傳染病具有重要的意義[7]。與滅活疫苗相比口服疫苗能夠直接進(jìn)入腸道并誘導(dǎo)產(chǎn)生局部免疫，同時(shí)避免因注射免疫對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激和病原的散播。

本實(shí)驗(yàn)用毒力基因缺失大腸桿菌口服免疫斷奶仔豬后，突變菌可在腸道內(nèi)停留21 d，免疫仔豬產(chǎn)生了特異性IgG抗體和局部sIgA抗體，IFN-γ含量升高，對(duì)SLT-Ⅱe的攻擊具有保護(hù)作用，說(shuō)明該基因突變菌株誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了特異性局部免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[15-16]，這一結(jié)果進(jìn)一步表明該突變菌株可作為仔豬水腫病口服疫苗。盡管從實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組的樣品中均檢測(cè)到了特異性的IgG和sIgA，但實(shí)驗(yàn)1組的免疫效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)2組，可能與進(jìn)入腸道的活菌數(shù)量有直接關(guān)系。微膠囊可以保護(hù)口服免疫菌株免受胃液影響[17]，而直接口服無(wú)微膠囊保護(hù)的突變菌后，由于胃液的作用，到達(dá)腸道的活菌數(shù)量大大減少。微膠囊雖然對(duì)細(xì)菌有保護(hù)作用，但會(huì)增加疫苗的生產(chǎn)成本，能不能通過(guò)直接增加口服免疫劑量來(lái)增加到達(dá)腸道的細(xì)菌數(shù)量尚需進(jìn)一步研究。

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