3種抗生素對3種常見魚類病原菌的抑菌活性研究

蘇振霞，肖 輝，陳列歡

(1.淮海工學院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院甲殼素研發(fā)中心，江蘇 連云港 222003)

近十幾年來，我國水產品養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，水產品產量居世界首位，但也不斷出現各種魚類疾病[1]。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是引起魚類疾病的主要病原菌[2-4]，目前對魚病的防治主要是利用化學藥品、抗生素或者致弱疫苗。水產養(yǎng)殖中抗菌藥物的長期使用或濫用所引起的致病菌耐藥性問題屢見不鮮[5-6]，而濫用抗生素和用藥方法不當是導致病原菌產生耐藥性的主要原因。因此，應該重視抗生素類藥物在水產養(yǎng)殖中的正確使用。

在水產養(yǎng)殖中對于正確選用抗菌漁藥、減少耐藥性及減少經濟損失，是十分重要和必要的。本實驗研究3種常用喹諾酮類抗生素藥物對3種水產病原菌的體外藥效學特性。通過測定抑菌圈直徑、最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)及殺菌曲線，為這3種抗生素在水產養(yǎng)殖上的正確應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 菌種實驗用嗜水氣單胞菌、鰻弧菌和哈維氏弧菌由淮海工學院海洋學院生物技術實驗室提供。

1.2 藥品實驗所用的3種抗生素為：鹽酸恩諾沙星購自太原博銳生物技術有限公司，含量≥98.5%；乳酸恩諾沙星購自江西博大動物保健品有限公司，含量≥98.5%；乳酸諾氟沙星購自鄭州亞衛(wèi)中升生物科技有限公司，含量≥98.5%。

1.3 抑菌圈的測定 將100 μL菌液均勻涂抹于固體培養(yǎng)基平板(直徑90 mm)。嗜水氣單胞菌使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，鰻弧菌和哈維氏弧菌使用LB培養(yǎng)基。用打孔器在每個平板上打3個孔，孔中加入藥液。28℃培養(yǎng)24 h。觀察并用游標卡尺測量抑菌圈。

1.4 MIC的測定 MIC的測定采用雙倍試管稀釋法[7]。

1.5 MBC的測定 在MIC試驗基礎上從無細菌生長的各管取材分別涂布于相應的無菌瓊脂平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察結果。瓊脂平板上無細菌生長且含藥液最少管的藥液濃度，即為該種藥物對該菌的最低殺菌濃度(Minimum bacteriacidal concentration，MBC)。

1.6 殺菌曲線 將菌種培養(yǎng)至對數生長期，用鹽酸恩諾沙星做鰻弧菌的殺菌曲線，乳酸諾氟沙星做嗜水氣單胞菌和哈維氏弧菌的殺菌曲線。以各時間點cfu/mL值的常用對數(1og)為縱坐標，以孵育時間(h)為橫坐標，繪制不同藥液濃度下的殺菌動力學曲線。

2 結果與討論

2.1 抑菌圈的結果分析 目前對水產養(yǎng)殖動物細菌病進行控制的主要手段是采用抗菌藥物治療，因此在使用藥物治療細菌性疾病之前，必須測定該藥物對病原菌的抗菌作用。由表1可知，鹽酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好，乳酸諾氟沙星對鰻弧菌和哈維氏弧菌的抑菌效果最好。

2.2 MIC和MBC結果分析 本試驗結果顯示鹽酸恩諾沙星對鰻弧菌的抑菌效果最好，乳酸諾氟沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好(表2)，與抑菌圈的測定結果相符合。關于喹諾酮類藥物對鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的抑菌作用的研究報道不太多，樊海平等2005年報道過鹽酸恩諾沙星對鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的MIC和MBC[8]。楊雨輝2003年報道過鹽酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC[9]。

哈維氏弧菌引起的大范圍發(fā)病會給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經濟損失。目前尚缺乏對此種菌的快速檢測技術及預防措施，因此對該菌進行藥物抑菌活性研究是非常必要的。本試驗的研究結果顯示，乳酸諾氟沙星對哈維氏弧菌的抑菌作用最明顯，本試驗中諾氟沙星對哈維氏弧菌的MIC為1.954 μg/mL，與郝貴杰等測得諾氟沙星粉對哈維氏弧菌的MIC 0.156 mg/L相比較具有較大的差異[10]。

不同的研究者測得的藥物抑菌活性的數值不盡相同，原因可能與藥物的純度、生產廠家、菌種的來源等有關。影響藥物抗菌作用測定的因素很多，菌液濃度影響藥物的MIC值，且菌液濃度變化引起MIC值大小的變化因藥物不同而異。培養(yǎng)基的選擇也會影響到藥敏試驗的結果[11]。

鹽酸恩諾沙星和乳酸恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌效果較好，MBC為7.183 μg/mL；3種抗生素對鰻弧菌的殺菌效果都較弱，鹽酸恩諾沙星和乳酸恩諾沙星對其殺菌效果要好于乳酸諾氟沙星，MBC為62.5 μg/mL；乳酸諾氟沙星對哈維氏弧菌的殺菌效果最好，MBC為31.25 μg/mL。

表1 3種抗生素對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌和哈維氏弧菌的抑菌圈Table 1 The inhibition zone of three FQs againstAeromonas hydrophila,Vibrio anguillarumandVibrio harveyi

表2 3種抗生素對3種病原菌的MIC和MBC(μg/mL)Table 2 The MIC&MBC values of three FQs against Aeromonas hydrophila,Vibrio anguillarumandVibrio harveyi

2.3 殺菌曲線 對照組在24 h內以一定的速率增長，尤其在4 h～12 h內增長速率明顯大于其它的時間段。2 MIC、4 MIC和8 MIC的乳酸諾氟沙星藥液對嗜水氣單胞菌都具有殺菌作用，隨著時間的增長殺菌作用更明顯，在24 h內完全殺滅。其中8 MIC的乳酸諾氟沙星藥液對嗜水氣單胞菌的殺菌作用最好，在12 h內完全殺滅(圖1)。

圖1 乳酸諾氟沙星對嗜水氣單胞菌的殺菌曲線Fig.1 Killing kinetics curve of lactic norfloxacin against Aeromonas hydrophila

對照組在24 h內以一定的速率增長，尤其在4 h～12 h內增長速率明顯大于其它的時間段。2 MIC、4 MIC和8 MIC的鹽酸恩諾沙星藥液對鰻弧菌都具有殺菌作用，隨著時間的增長殺菌作用更加明顯，在24 h內全部殺滅(圖2)。

圖2 鹽酸恩諾沙星對鰻弧菌的殺菌曲線Fig.2 Killing kinetics curve of enrofloxacin hydrochloride against Vibrio anguillarum

對照組在24 h內以一定的速率增長。2 MIC、4 MIC和8 MIC的乳酸諾氟沙星藥液對哈維氏弧菌都具有殺菌作用，隨著時間的增長殺菌作用更加明顯，在24 h內全部殺滅。在2 h～12 h之內2 MIC的藥液對鰻弧菌的殺菌作用與4 MIC和8 MIC的藥液相比具有較大的差別，8 MIC藥液具有更好的殺菌效果(圖 3)。

圖3 乳酸諾氟沙星對哈維氏弧菌的殺菌曲線Fig.3 Killing kinetics curve of lactic norfloxacin against Vibrio harveyi

水產養(yǎng)殖中的給藥方法主要有浸浴和口服，一般要求藥物為水溶性，因而使用藥物的劑量應根據水溶性藥物的MIC與MBC值來指導給藥劑量。只有當藥物在動物體的靶組織或體液中達到MIC值時，方可起效；過低的藥物濃度，不但不能起到防止疾病流行的目的，反而會提高病原生物的耐藥性并引起動物的肝損傷。同樣，通過殺菌曲線可見，有些藥物在短時間內不能殺滅病原體，因此使用不同藥物浸浴防治疾病，應保持不同的時間才能殺滅致病菌，達到控制疾病的目的。

藥物敏感性測定作為篩選藥物的主要依據，它仍將是氟喹諾酮類藥物研究的重點。能夠影響藥物對細菌抑制作用的因素很多，因此要科學準確地測定藥物的抗菌作用，必須最大程度的減少乃至排除各種主客觀因素的影響。目前，國內對氟喹諾酮類藥物在水產動物的研究較少，為了盡快使氟喹諾酮類藥物在水產動物疾病的防治中得到合理應用，今后還有待進一步研究FQs在水產動物體內的藥代動力學及殘留，這對于有效控制水產動物常見細菌性疾病的發(fā)生和流行將有重要的意義。

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