王秋霞，田 凱，李 杰，趙敬翠，劉明春

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

四環(huán)素類藥物是發(fā)現(xiàn)于上個(gè)世紀(jì)40年代的一類廣譜抗生素，從50年代開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床[1]。由于其具有抗菌譜廣和毒性低等特點(diǎn)，因而在獸醫(yī)臨床上得到廣泛應(yīng)用，成為用于防治細(xì)菌性感染的常見藥物。隨著藥物使用年限的增加，四環(huán)素類藥物的耐藥水平和耐藥率也隨之增強(qiáng)。有研究顯示，分離自豬、牛、人的大腸桿菌O157對四環(huán)素的耐藥率極高(97%，100%，100%)[2]，在184株沙門菌分離株中，四環(huán)素的耐藥率達(dá)到了66%[3]。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了40多種不同類型的四環(huán)素耐藥基因，主要介導(dǎo)3種不同的耐藥機(jī)制，分別為核糖體保護(hù)機(jī)制(Target protection)、外排泵機(jī)制(Active efflux)和酶降解機(jī)制(Enzymatic degradation)[4]。其中，外排泵機(jī)制對細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生發(fā)揮著重要的作用。因此，研究四環(huán)素外排泵耐藥基因的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，對治療耐藥細(xì)菌的感染、控制耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和耐藥性的傳播等方面都具有極其重要的意義。

1 已發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素外排泵耐藥基因

四環(huán)素的外排泵耐藥基因通過編碼膜相關(guān)蛋白使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)四環(huán)素主動(dòng)泵出胞外，從而起到降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度及保護(hù)細(xì)菌的作用，同時(shí)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。自從四環(huán)素外排泵基因tetA在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)以來，目前已經(jīng)有20多種四環(huán)素外排泵基因在革蘭氏陽性菌和陰性菌中相繼被發(fā)現(xiàn)[5]。其中包括，發(fā)現(xiàn)較早的tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH、tetZ、tetI、tetJ、tet30、tetL、tetK、otrB、tcr3、tetA(P)；以及分支桿屬(Mycobacterium)的 tetV[6]、鏈霉菌屬(Streptomyces)的 otrC[5]、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)的 tet33[7]、水生細(xì)菌哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的tet35[8]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 tet38[9]、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)的 tet39[10]。這些基因大多數(shù)存在于可移動(dòng)基因元件中(如：質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、插入序列元件和整合子)，并常與其他耐藥基因相連，使細(xì)菌表現(xiàn)出多重耐藥性。

2 新發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素外排泵耐藥基因

2.1 與其他基因串聯(lián)的四環(huán)素外排泵耐藥基因tet40的發(fā)現(xiàn) Scott等從分離自一位曾長期接受四環(huán)素治療的健康志愿者糞便樣品的化糖梭狀芽胞桿菌K10(Clostridium saccharolyticumK10)中發(fā)現(xiàn)了一種新的四環(huán)素耐藥基因tet40(AJ295238)。tet40編碼一種膜結(jié)合蛋白，與TetA(P)氨基酸的同源性為42%。在表達(dá)該蛋白的大腸桿菌中，四環(huán)素不能積聚；而且當(dāng)攜帶tet40的大腸桿菌在含有外排泵抑制劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌對四環(huán)素的耐藥性也會(huì)隨之降低。因此，推測tet40編碼外排泵蛋白，發(fā)揮外排泵耐藥機(jī)制。tet40的基本信息見表1。

表1 新發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素外排泵耐藥基因的基本信息Table 1 foundational information of novel tetracycline efflux genes

2.1.1 tet40耐藥基因及其編碼蛋白

在四環(huán)素耐藥的化糖梭狀芽胞桿菌K10中，發(fā)現(xiàn)了3種四環(huán)素耐藥基因，其中兩種是介導(dǎo)核糖體保護(hù)蛋白耐藥的tetW和同源嵌合體tet(O/32/O)，另一種是新發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)外排泵耐藥的tet40[12]。tet40位于tet(O/32/O)終止密碼子下游區(qū)50個(gè)核苷酸處，與tet(O/32/O)這樣的嵌合體不同，擁有獨(dú)自的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome binding site，AGGAG)和標(biāo)準(zhǔn)的Pribnow-Gilbert box(-10TATAA和-35TTAACA)。tet40的G/C含量為56.5%，而tet(O/32/O)編碼區(qū)的G/C含量為41%，這表明tet(O/32/O)和tet40應(yīng)該源于不同的供體微生物。

tet40編碼的蛋白質(zhì)與產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)的四環(huán)素外排泵蛋白TetA(P)、TetA408(P)的氨基酸序列同源性分別為42%和43%[13-14]。分析發(fā)現(xiàn)，Tet40和 TetA(P)、TetA408(P)的外排蛋白基序 E60x P62xxxxxD68xxxR72R73非常保守，而且它們的共有基序ExPxxxxxDxxxRK也非常相似。Tet40的氨基酸殘基與TetA(P)主要的功能區(qū)氨基酸序列 62、63、119、122、137、233、236和361位的脯氨酸、蘇氨酸、兩個(gè)丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和絲氨酸高度保守。Tet40上分別位于53、60和90的3個(gè)推測的谷氨酸殘基與TetA(P)的3個(gè)重要的谷氨酸殘基也是高度同源的[12]。同時(shí)，Tet40還同TetA(P)一樣有12個(gè)跨膜區(qū)。Tet40與TetA(P)的氨基酸序列同源性達(dá)42%。根據(jù)氨基酸同源性劃分四環(huán)素外排蛋白的方法，TetA(P)和Tet40同屬于第四類外排泵蛋白，在革蘭氏陽性梭菌屬中較為常見[15]。

2.1.2 tet40的分布和特點(diǎn) 2008年之前的研究普遍認(rèn)為化糖梭狀芽胞桿菌K10攜帶兩個(gè)核糖體保護(hù)類型的耐藥基因，tetW和嵌合體tet(O/32/O)[16-17]。直到最近，才發(fā)現(xiàn)了與tet(O/32/O)串聯(lián)存在的另一個(gè)四環(huán)素耐藥基因tet40。許多相同或不同機(jī)制的四環(huán)素耐藥基因都可以在同一活動(dòng)基因元件上存在，如tetM和tetL[18]，tetA408(P)和tetM[14]，tetA(P)和tetB(P)[13]，這可能是導(dǎo)致耐藥基因廣泛存在、耐藥性迅速增強(qiáng)的原因之一。上述現(xiàn)象與tet(O/32/O)嵌合體一樣，都是在藥物強(qiáng)大選擇壓力作用下的產(chǎn)物。而與tet(O/32/O)不同的是，在化糖梭狀芽胞桿菌K10中tet(O/32/O)和tet40相互不重疊，有不同的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，但能共同通過相同的轉(zhuǎn)運(yùn)因子轉(zhuǎn)移。

tet40具有自己的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和Pribnow-Gilbert box。對tet40的單獨(dú)研究發(fā)現(xiàn)，在沒有與tet(O/32/O)串聯(lián)的情況下，四環(huán)素對攜帶tet40基因的大腸桿菌的半數(shù)抑制濃度(IC50)為60 μg/mL，遠(yuǎn)高于未轉(zhuǎn)入tet40前的2 μg/mL。這表明在實(shí)驗(yàn)室條件下，tet40可以單獨(dú)存在，并介導(dǎo)對四環(huán)素的耐藥。

串聯(lián)存在的核糖體保護(hù)蛋白基因和外排泵基因可介導(dǎo)宿主細(xì)胞更高水平的四環(huán)素耐藥性。tet(O/32/O)是豬和人糞便樣品中檢出率較高的四環(huán)素耐藥基因之一[17]。tet40可能像tet(O/32/O)一樣是一種在腸道菌群中大量存在的四環(huán)素耐藥基因。tet40在化糖梭狀芽胞桿菌K10的檢出表明，外排泵基因不僅介導(dǎo)革蘭氏陰性菌的耐藥[5]，也可介導(dǎo)革蘭氏陽性菌對四環(huán)素的耐藥。

2.2 古細(xì)菌中的四環(huán)素外排泵耐藥基因tet42的發(fā)現(xiàn)Brown等在美國華盛頓州的Energy Hanford Site(HS)距地表170 m～210 m深處提取到一些沉積物的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的四環(huán)素耐藥基因，tet42(EU523697)[19]。Tet42蛋白質(zhì)具有外排蛋白的特征，與TetA(Z)有30%氨基酸序列同源性，因此推測其編碼外排泵蛋白，發(fā)揮外排泵耐藥機(jī)制。tet42的基本信息見表1。

2.2.1 tet42耐藥基因及其編碼蛋白 Tet42包括一個(gè)TetR轉(zhuǎn)錄抑制物、一個(gè)保守的GxxSDRxGRR基序和跨膜區(qū)。tet42含有兩個(gè)不同的可轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框架(ORFs)。短一些的ORF(612核苷酸)與tetA的抑制物tetR相似；另一個(gè)ORF(1287核苷酸)與已知的四環(huán)素外排泵基因序列的同源性較低。

長一些的ORF編碼一個(gè)429個(gè)氨基酸的序列，與TetA(Z)的同源性為30%[20]，與已知四環(huán)素耐藥決定子的同源性小于80%，因此根據(jù)當(dāng)前的命名規(guī)則[21]將其命名為TetA(42)。TetA(42)可能有十個(gè)跨膜區(qū)，分別位于aa 19 ～aa 41、aa 51～aa 73、aa 85～aa 107、aa 112～aa 131、aa 143～aa 165、aa 169～aa 191、aa 228～aa 250、aa 260～aa 282、aa 291～aa 313和aa 378～aa 400。這與已知的外排泵蛋白含有12或14個(gè)跨膜區(qū)的特點(diǎn)大不相同[22]。TetA(42)還包含一個(gè)所有四環(huán)素外排泵序列都普遍存在的 GxxSDRxGRR基序[23]，TetA(42)中的該區(qū)域(GrlSDRfGRR)與TetA(Z)的相同。短一些的ORF命名為TetR(42)，含204個(gè)氨基酸，與Streptomyces ambofaciens的TetR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子有41%氨基酸同源性[24]，可能是四環(huán)素耐藥的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。

tetA(42)和tetR(42)是反向的。這兩個(gè)ORFs之間存在一個(gè)71 bp的基因間區(qū)域，包含tetA(42)和tetR(42)各自的TetR結(jié)合操縱基因和啟動(dòng)子[22-23]。tetR(42)操縱基因(CGACAGTCTATCG)和 tetA(42)操縱基因(GACTACACT TTCG)不是理想的回文序列，其中有7個(gè)堿基不同。兩個(gè)操縱基因的前半段序列不太相似，但后半段序列除了一個(gè)堿基外都相同。

2.2.2 tet42的分布和特點(diǎn) 攜帶tet42的細(xì)菌分離自地下深處距今300萬年的沉積物中[25]，它們沒有接觸過化學(xué)合成的抗生素，更沒有接觸過大量、長期抗生素選擇壓力下演化而來的耐藥基因。但這些菌株卻對包括四環(huán)素在內(nèi)的幾種抗生素表現(xiàn)出一定的耐藥性。含有tet42的耐藥轉(zhuǎn)化株與不含tet42的野生型菌株對四環(huán)素的敏感性不同，最小抑菌濃度(MIC)從4 μg/mL增加到32 μg/mL。而且分離自沉積物中的7個(gè)菌株都檢測到了tet(42)基因。研究表明，HS的沉淀物中發(fā)生了水平基因傳遞(HGT)；存在于沒有抗生素的環(huán)境中的菌株同樣具有抗生素耐藥性，菌體內(nèi)的外排泵蛋白可能與其清除重金屬或其他毒素的功能有關(guān)[26-27]。

這一遠(yuǎn)離地面影響的新基因的發(fā)現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和耐藥基因的演化提供了實(shí)際依據(jù)，也為存在于環(huán)境中但尚未檢測到的非特異性的耐藥機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提供了可行性依據(jù)。

3 展望

四環(huán)素耐藥基因廣泛存在于人、動(dòng)物和環(huán)境的細(xì)菌中[3,28]，對人類健康、用藥安全和環(huán)境衛(wèi)生等構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅和危害。在藥物選擇壓力下，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)及傳播問題已經(jīng)成為藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)議題。研究耐藥基因和耐藥機(jī)制，將為更好的應(yīng)對菌株耐藥性的產(chǎn)生及尋求科學(xué)合理的解決方案發(fā)揮著積極、重要的作用。

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