銀杏葉提取物對老年大鼠術(shù)后認(rèn)知障礙的防治作用

鹿洪秀，蘇 帆，馬德東

由于老年人術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）的發(fā)病機制尚未完全研究清楚，目前還沒有有效的防治措施，只能從引起POCD的相關(guān)因素著手，在圍術(shù)期予以妥善處理，達到預(yù)防目的[1-2]。本研究通過老年大鼠POCD模型，觀察銀杏葉提取物對POCD的防治作用。為觀察影響大鼠認(rèn)知功能改變的可能因素，我們采用了曠場分析實驗和血氧水平依賴（blood oxygen level dependent，BOLD）磁共振顯像進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性Wistar大鼠，≥20月齡，體質(zhì)量300～500g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物合格證號010153。

1.2 藥物及主要儀器 1%戊巴比妥鈉，購自上海西唐生物公司。銀杏葉提取物注射液，5mL含總黃酮醇甙4.2mg，銀杏內(nèi)酯A 0.30mg，北京雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。3.0T MRI顯像系統(tǒng)為美國GE公司制造。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 腹腔注射無菌1%戊巴比妥鈉40mg/kg，動物呼吸變深變慢，四肢肌肉軟弱無力，角膜反射遲鈍，說明已處于麻醉狀態(tài)。局部消毒，行左側(cè)股動脈穿刺，插入含1%肝素鈉的導(dǎo)管，接三通管。連接多功能監(jiān)護儀，持續(xù)監(jiān)測血壓、心率。剃去腹部毛發(fā)，消毒，行腹正中切口，長約4cm。按照腸管、肝、脾、腎臟次序作腹腔探查，完成后按照同樣順序重復(fù)探查，維持4 h。術(shù)中嚴(yán)格無菌操作，腸管等臟器牽拉至腹腔外時用無菌生理鹽水紗布覆蓋。至大鼠略蘇醒，追加1/3量戊巴比妥鈉，維持麻醉和手術(shù)4 h。術(shù)中耳緣靜脈輸注生理鹽水，術(shù)畢用0號線縫合切口，無菌紗布覆蓋，蘇醒后放入籠中。術(shù)中予腹腔加溫生理鹽水滴注保持肛溫在37.5℃。麻醉過程中動物有時因呼吸道分泌物過多影響呼吸，可將動物舌頭拉出口腔，保持動物呼吸通暢。術(shù)后常規(guī)腹腔注射青霉素鈉，以防并發(fā)感染。

1.3.2 分組及治療 隨機將動物分為實驗組(A組和B組)和空白對照組（C）。實驗組共30只，按上述方法行腹腔探查維持4 h；其中15只自術(shù)前1周開始給予銀杏葉注射液0.5mL腹腔注射,1次/d，為治療組(A組)；15只探查同時給予等量的生理鹽水作為對照（B組）；空白對照組15只（C組），僅腹腔注射同等容量的無菌生理鹽水，每日1次，不做腹腔探查。

1.3.3 學(xué)習(xí)記憶功能檢測 實驗鼠于上午8:00～11:00對其進行Y型迷宮實驗(實驗在安靜、光線較暗的環(huán)境中進行)，Y型迷宮內(nèi)設(shè)起步區(qū)、電擊區(qū)和安全區(qū)，先將大鼠放入迷宮箱內(nèi)適應(yīng)5min。大鼠能從起步區(qū)(在5 s內(nèi))直接逃避至安全區(qū)為正確，否則為錯誤反應(yīng)。每測1次休息30 s，測定10次休息5min，達到學(xué)會的標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)10次測試中有9次為正確。記錄每只大鼠達到學(xué)會標(biāo)準(zhǔn)前所需的訓(xùn)練次數(shù)(剔除反應(yīng)敏捷的大鼠)，48 h后再次測試10次，其中正確反應(yīng)所占比例為大鼠的記憶成績。麻醉手術(shù)前后均進行測試。

1.3.4 曠場分析試驗檢測 曠場分析箱高40cm，長和寬均為80cm，周壁為黑色，底面為面積相等的25塊方格，沿墻壁稱外周格，其余為中央格，將大鼠放入曠場反應(yīng)箱正中格中，觀察3min內(nèi)大鼠的活動情況。采用單盲法，設(shè)2位觀察者，分別觀察不同指標(biāo)包括大鼠理毛次數(shù)，中央格內(nèi)停留時間，跨格次數(shù)(3爪以上跨入鄰格的次數(shù))和站立次數(shù)(兩前肢離地 1cm以上)。每次測試后，清洗曠場周壁及底面，以免上次動物余留的信息影響下次測試結(jié)果，測試時機也是在麻醉手術(shù)前后進行。實驗時間為每天上午8:00～12:00，麻醉手術(shù)后第 1 d進行曠場分析試驗，并記錄成績。

1.3.5 MRI掃描 老年大鼠給戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后進行BOLD成像。首先掃描軸位、冠狀位及矢狀位的T2加權(quán)圖像，了解大腦及周圍解剖結(jié)構(gòu)；選取腦組織最大截面方向進行BOLD掃描。以不同TE值（20～140 ms，間隔20 ms）掃描一系列GRE序列圖像，用以計算R2*值（BOLD信號強度）。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)在GE工作站作初步處理，觀察灌注顯像圖，導(dǎo)出Dicom格式原始數(shù)據(jù)，將Dicom數(shù)據(jù)導(dǎo)入IDL6.0中采用自定義參數(shù)及語句按每像素計算R2*值。對lnS(t)及TE值進行最小方差法直線擬合，該直線的斜率即是-R2*值（單位是s-1）。

2 結(jié)果

2.1 迷宮記憶功能成績 實驗結(jié)果表明A組動物的記憶功能在術(shù)前、術(shù)后未見明顯改變，但B組記憶功能顯著低于C組，曠場試驗成績亦明顯降低（表1）。

表1 大鼠迷宮記憶功能成績()

表1 大鼠迷宮記憶功能成績()

注:與術(shù)前比較，*P＜0.05；與B組比較，$P＜0.05

組別A組B組C組n 151515術(shù)前9.10±1.229.00±0.899.03±1.06術(shù)后1天8.68±1.30$6.89±0.76*9.11±0.87$

2.2 MRI BOLD氧水平 MRI T2加權(quán)圖像顯像結(jié)果如圖1所示，用以顯示解剖結(jié)構(gòu)；圖2為不同TE值顱內(nèi)信號強度變化。該顯像原始DICOM數(shù)據(jù)導(dǎo)入IDL內(nèi)計算每個象素的參數(shù)，并用于BOLD的計算。不同TE值下信號強度自然對數(shù)圖的擬合直線的斜率為-R2*。R2*即反映了乏氧的程度:乏氧越嚴(yán)重，R2*值越大，反之越小。三組大鼠BOLD結(jié)果顯示，B組大腦R2*平均值明顯高于A組大鼠（P＜0.05），C組雖然也高于A組，但無統(tǒng)計學(xué)意義，且顯著低于B組（P＜0.05，表2）。

圖1 實驗大鼠顱腦矢狀位T2加權(quán)圖像

表2 大鼠BOLD顯像R2*結(jié)果比較()

表2 大鼠BOLD顯像R2*結(jié)果比較()

注:與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別A組B組C組n 151515 R2*（s-1）8.9±5.5629.0±3.40*13.2±8.16#

圖2 大鼠顱腦不同TE值冠狀位T2*圖像

2.3 MRI BOLD氧水平檢測對記憶功能的關(guān)系 記憶功能評分與BOLD結(jié)果相關(guān)性分析顯示，二者相關(guān)系數(shù)r=-0.824，P＜0.05，高供氧代謝狀態(tài)可以預(yù)測較好的認(rèn)知功能。

2.4 銀杏葉提取物對老年大鼠POCD的防治作用 A組與B組相比，術(shù)后認(rèn)知評分明顯改善（P＜0.05，表1），較術(shù)前雖有降低但無統(tǒng)計學(xué)差異。曠場試驗分析，各項指標(biāo)A組較B組均有明顯改善（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠曠場分析試驗檢測結(jié)果()

表3 大鼠曠場分析試驗檢測結(jié)果()

注:與術(shù)前比較，*P＜0.05；與A組比較，$P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05

組別A組B組C組n 術(shù)前（3min）術(shù)后1天（3min）151515理毛次數(shù)(次)2.5±1.22.3±1.52.6±1.1中央格時間（s）2.9±1.92.5±1.22.6±1.4夸格次數(shù)(次)25.3±16.523.9±14.522.7±15.9站立次數(shù)(次)7.0±4.67.9±6.56.7±7.9理毛次數(shù)(次)2.1±1.61.2±1.0*$2.2±1.7#中央格時間（s）3.2±1.54.0±1.1*2.3±1.9#夸格次數(shù)(次)22.3±14.212.1±15.1*$19.6±20.4#站立次數(shù)(次)6.3±3.63.2±2.9*$5.5±27#

3 討論

我國面臨日益嚴(yán)重的人口老齡化問題，而且老年人面臨麻醉和手術(shù)的機會較多，術(shù)后可能會發(fā)生POCD。老年人一旦發(fā)生POCD，除自己的獨立生活能力下降外，還對社會造成沉重的負擔(dān)[3]，預(yù)防其發(fā)生比治療具有更重要的意義。目前對POCD尚沒有令人滿意的防治方法，因此通過POCD動物模型探索中藥的防治作用有著重要意義。

動物模型中常用的認(rèn)知功能檢測方法包括曠場分析試驗和迷宮試驗。曠場分析試驗主要反映動物對新環(huán)境的探究[4]、習(xí)慣以及伴隨的情緒變化。中央格停留時間是動物空間認(rèn)知能力的反映，正常動物會避開空曠環(huán)境，迅速離開中央格，沿周邊活動[5]。如果對新環(huán)境的認(rèn)知能力差，則大鼠停留在中央格的時間就會延長。站立行為和站立次數(shù)是動物探索行為及興奮性的反映，認(rèn)知較差的大鼠探索行為下降，興奮性顯著降低，對新環(huán)境的適應(yīng)性比正常動物差。理毛是動物對新環(huán)境滿意程度的反映，理毛時間延長，反映對新環(huán)境的適應(yīng)能力強。也與動物的興奮性有關(guān)，在恐懼、緊張及不安時常表現(xiàn)出的一種行為。過去人們在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)動物處于恐懼狀態(tài)時，這一行為有加強的趨勢。認(rèn)知是個復(fù)雜的腦功能活動，本課題通過腦功能成像技術(shù)，在整體水平探索全麻藥物對大腦的作用機制，以立體三維空間圖像對麻醉過程中及術(shù)后腦認(rèn)知功能進行活體、微區(qū)、瞬間、動態(tài)、無損傷研究，從而為預(yù)防、診斷探索一條新的方法，為治療POCD提供新的新的理論依據(jù)。

中藥制劑銀杏葉提取物國內(nèi)外均有報道，對大腦及血腦屏障有保護作用，并對腦代謝和神經(jīng)遞質(zhì)有一定影響。銀杏葉提取物能夠降低血黏度，降低血小板聚集性，幫助血液更順利地通過最為細小和狹窄的血管，使大腦、心臟和四肢的組織中缺氧的部分獲得營養(yǎng)。最重要的是，銀杏不僅能夠?qū)⒀鯕夂脱焊嗟剌斔偷浇】挡糠?，而且是一種高效的抗氧化物，能有效清除自由基、防止高脂肪細胞膜被氧化。因此，銀杏葉能夠改善臨床癥狀和神經(jīng)功能缺損，具有增強中樞膽堿能功能，改善心腦循環(huán)的作用，有利于腦缺血性損傷與記憶等功能的恢復(fù)，對改善老年記憶功能起到有益的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，銀杏葉制劑可以預(yù)防老年性POCD。本研究中，銀杏葉組防治大鼠認(rèn)知功能障礙各項指標(biāo)，與空白對照組相比均有改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，治療期間未發(fā)現(xiàn)有明顯副作用。

本研究首次活體觀察了銀杏葉提取物對POCD模型腦組織供氧的影響，證實了其改善腦組織供氧水平的功能，并且這種供氧的改善與認(rèn)知功能密切相關(guān)。據(jù)此我們認(rèn)為，其機制可能與改善腦組織血氧水平有關(guān)。本研究只對術(shù)后第1天發(fā)生POCD的情況進行觀察，今后可進一步延長觀察時間。銀杏提取物作為一種有應(yīng)用前景的預(yù)防POCD的藥物，可嘗試在臨床試用。

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