湯召兵，茍 欣，王 明，何衛(wèi)陽，劉朝東，鄧遠忠，李 杰，陳 勇，任 軻（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科，重慶市 400016）

鋁在環(huán)境中大量存在，故人的一生中暴露于鋁是不可避免的。在日常生活中，鋁經(jīng)過飲水、食物等被人體吸收，尤其對于特殊人群如鋁從業(yè)者、長期使用含鋁的藥物及化妝品者，則增加了其鋁的攝入量。鋁在體內聚積可引起人類多種疾病，如透析性癡呆、老年性癡呆、非缺鐵性小紅細胞性貧血、軟骨病等[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，氯化鋁（AlCl3）對動物具有胚胎毒性，可致畸胎形成。食入過多的鋁可使其在靶器官內聚積，對人及動物的睪丸組織均有損害作用。精子的存活率和活動率都與體內精子及精漿中含鋁的濃度相關，鋁的濃度越高，精子存活率和活動率越低。但在體外試驗中，有關鋁的生殖毒性的研究文獻報道還較少，Yousef等[3]證實在體外，鋁同樣具有生殖毒性作用。美洛昔康為新一代非甾體類抗炎藥，具有顯著而持久的抗炎作用及一定的止痛、解熱作用，安全性、耐受性好，已在臨床廣泛使用。美洛昔康在臨床上使用的常規(guī)劑量為每日15 mg，其副作用較少，主要表現(xiàn)為胃腸道反應，也有少數(shù)出現(xiàn)過敏反應。有研究[4]證實，美洛昔康對鋁所致的神經(jīng)系統(tǒng)損害也具有顯著的保護作用。本文通過體外試驗研究AlCl3對人精子的毒性作用及美洛昔康對其的干預作用，以期為臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WLJY-2008型電腦自動精液采集分析儀（北京偉力新世紀科技發(fā)展有限公司）；CX21顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

美洛昔康片（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，批號:070502，規(guī)格:每片15 mg）；六水三氯化鋁（AlCl3·6H2O）（大連雪源精細化工有限公司，國產(chǎn)分析純）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）檢測試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司）。

1.3 精液

收集健康男性（年齡25～35歲）精液標本，經(jīng)分析各項指標均符合世界衛(wèi)生組織（WHO）相關標準，其中精液量≥3 mL，精子濃度≥50×106個/mL，活動率≥70%，共收集精液標本5份。

2 方法

2.1 溶液的制備

取AlCl3·6H2O，加蒸餾水稀釋制成濃度分別為5、10、15 mol·L－1的AlCl3溶液。另取美洛昔康片，精密稱定，碾磨成粉，加蒸餾水稀釋制成濃度為1×10－5mol·L－1的美洛昔康溶液。

2.2 分組處理

精液標本放置于37℃水浴箱中，液化后，每份精液作如下處理:用精子營養(yǎng)液將精液稀釋至1×106個/mL，調節(jié)pH為7，然后均分為8份，4份為1組，每組4個亞組，第1組為對照組（生理鹽水）和AlCl3低、中、高劑量組（5、10、15 mol·L－1），每組加入相應藥物；第2組在第1組的基礎上，除對照組改為加入美洛昔康1×10－5mol·L－1外，其余3組均預先加入美洛昔康1×10－5mol·L－1。

2.3 精子存活率與活動率的檢測

以加入AlCl3后開始計時，在37℃水浴箱中培育0、2、4 h后檢測精子的存活率及活動率。用0.5%伊紅染色，光鏡下觀察著色的為死精子，未著色的為活精子，存活率（%）＝未著色精子數(shù)量/總精子數(shù)量×100%。精子活動率使用電腦自動精液采集分析儀進行檢測。

2.4 精漿中SOD及AST的檢測

取“2.3”項下各時間點的精漿，按試劑盒使用說明書檢測其中SOD和AST活性。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 精子存活率與活動率檢測結果

與相同時間點對照組比較，隨AlCl3濃度增加，精子存活率與活動率均降低（P＜0.05或P＜0.01），呈濃度依賴性；但當Al-Cl3濃度為5 mol·L－1時，作用0、2 h時精子存活率降低無明顯變化（P＞0.05），即對精子未產(chǎn)生明顯毒性作用。與第1組相同濃度及時間點比較，AlCl3中、高劑量組作用2、4 h時上述指標均有升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組精子存活率比較見表1，活動率比較見表2。

表1 各組精子存活率比較（%%，，n＝5）Tab 1 Comparison of survival rate of sperm（%%，，n＝5）

表1 各組精子存活率比較（%%，，n＝5）Tab 1 Comparison of survival rate of sperm（%%，，n＝5）

與相同時間點對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時間點比較:#P＜0.05；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

表2 各組精子活動率比較（%%，，n＝5）Tab 2 Comparison of activity ratio of sperm（%%，，n＝5）

表2 各組精子活動率比較（%%，，n＝5）Tab 2 Comparison of activity ratio of sperm（%%，，n＝5）

與相同時間點對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時間點比較:#P＜0.05，##P＜0.01；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05，##P＜0.01；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

3.2 精漿中SOD活性變化

與相同時間點對照組比較，AlCl3高劑量組SOD活性明顯降低（P＜0.05）。與第1組相同濃度及時間點比較，AlCl3高劑量組SOD活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組精漿中SOD活性比較見表3（表中數(shù)據(jù)為實測值×精液稀釋倍數(shù)）。

3.3 精漿中AST活性變化

與相同時間點對照組比較，第1組中作用2、4 h時AlCl3低、中、高劑量組AST活性幾乎全部明顯增強，第2組作用4 h時AlCl3中、高劑量組AST活性明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）。與第1組相同濃度及時間點比較，第2組作用4 h時Al-Cl3中、高劑量組AST活性明顯減弱（P＜0.05）。各組精漿中AST活性比較見表4（表中數(shù)據(jù)為實測值×精液稀釋倍數(shù)）。

4 討論

精子濃度、精子活動率及存活率是評判精子質量及生育力最重要的參數(shù)，處在氧化應激狀態(tài)下的人或動物，其精漿和血漿中的氧自由基明顯增加，產(chǎn)生過氧化作用從而損傷細胞膜、DNA及亞細胞器膜，進而對細胞功能產(chǎn)生顯著的不利影響，使精子質量明顯下降而致不育。SOD是精液中最重要的抗氧化防御劑，其活性高低可作為男性不育的判斷指標之一。有研究[5，6]提示，精漿中SOD活性低可作為診斷男性不育的參數(shù)之一。

有研究[7，8]證實，在體外、內鋁均顯示出氧化作用，能促進生物氧化。在本研究中，一定濃度的AlCl3加入精液中孵育一定時間后（濃度為15 mol·L－1、時間≥2 h），精子活動率及存活率明顯降低、SOD活性明顯受到抑制，且與AlCl3濃度及孵育時間具有明顯的依賴性，與Yousef等[3]研究報道結果一致。AST在精子代謝轉氨過程中有著重要作用。在本研究中，AlCl3增強了AST活性，與有關文獻[3，8]結果相近，AST活性增強可能是由于線粒體某些結構的改變從而引起AST漏出有關:孵育時間越長，AlCl3濃度越高，線粒體結構破壞越重，AST漏出越多；而在剛加入AlCl3時，線粒體結構尚未發(fā)生改變，雖然AlCl3濃度增加，AST活性卻無明顯變化。但文中其他3個指標由于比較敏感，所以在剛加入AlCl3時就表現(xiàn)出了明顯的差異。

表3 各組精漿中SOD活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 3 Comparison of SOD activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

表3 各組精漿中SOD活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 3 Comparison of SOD activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

與相同時間點對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時間點比較:#P＜0.05，##P＜0.01；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05，##P＜0.01；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

表4 各組精漿中AST活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 4 Comparison ofAST activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

表4 各組精漿中AST活性比較（U·mL－1，，n＝5）Tab 4 Comparison ofAST activity of sperm（U·mL－1，，n＝5）

與相同時間點對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第1組相同濃度及時間點比較:#P＜0.05；與相同濃度作用0 h組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01vs.control group at same time point:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the first group with same concentration at same time:#P＜0.05；vs.that group with same concentration treated for 0 h:△P＜0.05，△△P＜0.01

本研究結果表明，在體外，單純加入美洛昔康與生理鹽水比較，精子活動率、存活率及精漿SOD、AST活性在相同孵育時間下均無明顯差異，表明美洛昔康在相近于臨床治療血藥濃度時，對精液質量無明顯影響，即對生育力正常者，美洛昔康不會產(chǎn)生不利影響。但美洛昔康對AlCl3引起的精子毒性作用卻具有一定的保護作用，其可以減輕AlCl3對SOD活性的抑制作用、對AST活性的增強作用，精子活動率及存活率也有部分增強，但不能完全改善，其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，在體外試驗中，AlCl3對人精液具有明顯毒性作用，并表現(xiàn)出時間及濃度依賴性，美洛昔康對其具有明顯的改善作用。

[1]Suwalsky M，Norris B，Villena F，et al.Aluminum fluoride affects the structure and functions of cell membranes[J].Food Chem Toxicol，2004，42（6）:925.

[2]Cranmer JM，Wilkins JD，Smith L.Fetal-placental-maternal uptake of aluminium in mice following gestational exposure[J].Neurotoxicology，1986，7（2）:601.

[3]Yousef MI，Kamelb KI，El-Guendi MI，et al.An in vitro study on reproductive toxicity of aluminium chloride on rabbit sperm:the protective role of some antioxidants[J].Toxicology，2007，239（3）:213.

[4]蘇 強，楊俊卿，張 鵬.美洛昔康對慢性超負荷致神經(jīng)元退變大鼠海馬環(huán)氧化酶2表達的影響[J].中國藥理學與毒理學雜志，2009，23（1）:6.

[5]Shiva M，Gautam AK，Verma Y，et al.Association between sperm quality，oxidative stress，and seminal antioxidant activity[J].Clin Biochem，2011，44（4）:319.

[6]Ramya T，Misro MM，Sinha D，et al.Altered levels of seminal nitric oxide，nitric oxide synthase，and enzymatic antioxidants and their association with sperm function in infertile subjects[J].Fertil Steril，2011，95（1）:135.

[7]Exley C.The pro-oxidant activity of aluminum[J].Free Radic Biol Med，2004，36（3）:380.

[8]Yousef MI.Aluminium-induced changes in hematobiochemical parameters，lipid peroxidation and enzyme activities of male rabbits:protective role of ascorbic acid[J].Toxicology，2004，199（1）:47.