整體透明技術(shù)觀察懸鈴葉苧麻胚胎發(fā)育的方法研究

李彥坤，臧鞏固，趙立寧，李育君，唐 蜻，程超華

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

整體透明技術(shù)作為研究植物組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一種有效方法，近年來已經(jīng)被廣大科研工作者所熟悉，并越來越多的應用到各個科研領(lǐng)域。整體透明技術(shù)是用各種不同配比的透明劑來處理植物組織，處理后的材料中各個器官由于組成、顏色和厚度等存在差別，從而對光線的折射率不同，在微分干涉差(differential interference contrast，DIC)顯微鏡或相差顯微鏡下可以直接觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的方法[1]。在植物胚胎學的研究中，整體透明技術(shù)和其他傳統(tǒng)的研究方法相比，存在顯著的優(yōu)勢[2]。傳統(tǒng)的石蠟切片和整體解剖等方法耗時長、效率低，并且要求操作的技術(shù)人員具有一定的經(jīng)驗，因而在某些研究領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)漸漸被整體透明技術(shù)所替代。最早的整體透明技術(shù)是Herr于1971年提出的[3，4]，所使用的透明劑被稱為“Herr 41/2”，后來的許多透明劑都是在Herr 41/2透明劑的基礎(chǔ)上改進而來。Crane在1978年使用水楊酸甲酯作透明劑，對于胚囊的透明度較“Herr 41/2”的透明效果更好[5]。本試驗以懸鈴葉苧麻的雌花為材料，運用整體透明技術(shù)觀察其胚胎的發(fā)育[6，7]，并試驗不同的固定液與透明劑組合對透明結(jié)果的影響，旨在摸索適合懸鈴葉苧麻雌花的透明方法，并為快速判斷雌花發(fā)育階段提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗選用中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所收集并保存的懸鈴葉苧麻（Boehmeria tricuspis），取開花期的雌花組織作為試驗材料。所用化學試劑為分析純，用水為去離子水，觀察用顯微鏡為北京泰克立體顯微鏡XTL-20和Olympus微分干涉差顯微鏡BX51TRF。

1.2 試驗方法

懸鈴葉苧麻雌花的整體透明技術(shù)分為固定、脫水、透明、鏡檢幾個步驟，本試驗選用4種固定液和3種透明液組合使用，旨在摸索適合懸鈴葉苧麻的透明方法，并選取透明效果較好的組合深入試驗，以期進一步改善透明效果并提高透明效率。不同固定液和透明液配方見表1。

1.2.1 固定

對開花期的懸鈴葉苧麻雌花定期連續(xù)取材，取材后立即將新鮮雌花分別固定于配制好的卡諾固定液和FPA50中，每隔3～4小時更換一次固定液，換液2～3次即可，固定總時間為24小時或以上。固定后的材料保存于75%乙醇中。

1.2.2 脫水

水楊酸甲酯（即冬青油）作為透明劑：將材料轉(zhuǎn)入30%乙醇中進行脫水1小時，然后依次轉(zhuǎn)入50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇進行逐級脫水，每次脫水時間1小時。最后轉(zhuǎn)入無水乙醇徹底脫水，中間換液2次，最后一次脫水12小時以上。

Herr 41/2和BB41/2作為透明劑：無需脫水或95%乙醇稍加脫水即可。

1.2.3 透明

冬青油透明：將完全脫水后的懸鈴葉苧麻雌花轉(zhuǎn)入無水乙醇與冬青油等體積混合液中進行過渡，中間換液2-3次，每次時間1小時。然后經(jīng)純冬青油透明，中間換液2-3次，最后一次透明24小時以上。

Herr 41/2和BB 41/2：將保存于70%乙醇中的材料直接轉(zhuǎn)入或經(jīng)95%乙醇稍加脫水后轉(zhuǎn)入Herr 41/2或BB41/2中透明24小時或以上，期間更換透明液1～2次。

1.2.4 鏡檢

將透明好的材料連同透明劑轉(zhuǎn)移到載玻片上（若材料較厚，為取得較好效果可用淺凹玻片），加蓋玻片封存，在微分干涉差顯微鏡下觀察胚珠發(fā)育情況，比較不同固定液和透明液組合的透明效果。

表1 不同固定液和透明液的組成配方Table 1 The composition and proportion ofthe different solutions

2 結(jié)果與分析

2.1 不同固定液的脫色效果

除FPA50脫色效果不理想外，其他3種改進的卡諾固定液在長時間處理樣品后，脫色效果均較好。從表2中可以看出，卡諾1的脫色較迅速，在固定5小時后效果最好；固定24小時后卡諾1和卡諾2脫色效果近似，但優(yōu)于卡諾3；待一周以后卡諾1、2、3均脫色較好。

表2 不同固定液的脫色效果Table 2 Decolorization effects ofdifferent fixingsolutions

2.2 不同固定液和透明液的處理效果

用不同的固定液和透明液組合處理懸鈴葉苧麻雌花，并在顯微鏡下觀察胚珠的脫色效果、立體感、反差大小、清晰度等項。鏡檢時任意確定一個視野，隨機觀察30個胚珠，記錄內(nèi)部結(jié)構(gòu)可見的胚珠數(shù)，重復三次，并估算胚珠的透明率。試驗結(jié)果見表3。

從表3可以看出：（1）卡諾1和卡諾2固定液總體的脫色效果優(yōu)于卡諾3和FPA50，尤其卡諾1配合冬青油效果最好；（2）經(jīng)F檢驗對各組透明率進行顯著性分析，結(jié)果顯示脫色效果對胚珠的透明率高低有顯著影響，卡諾1和卡諾2固定的胚珠透明率顯著高于卡諾3和FPA50（P＜0.05）；（3）固定液相同透明劑不同的各組相比來看，卡諾3固定時冬青油作為透明劑的透明率顯著高于Herr 41/2和BB 41/2透明劑（P＜0.05），卡諾1和卡諾2固定時各組透明率沒有顯著差異（P＞0.05），F(xiàn)PA50固定時冬青油和Herr 41/2組透明率顯著高于BB 41/2組（P＜0.05）。（4）在鏡檢觀察效果方面，卡諾1固定組的立體感和反差整體優(yōu)于其他各組，并且在固定液相同時，冬青油透明的立體感和反差一般優(yōu)于Herr 41/2和BB41/2透明劑。

值得注意的是，大部分處理組合在顯微觀察胚胎發(fā)育時往往清晰度不高，尤其高倍鏡下觀察成像較模糊，只有卡諾1—冬青油組合和卡諾3—冬青油組合在高倍鏡下成像較為清晰，其中又以前者成像效果好。鑒于以上結(jié)果的綜合考慮，我們認為對于懸鈴葉苧麻的雌花組織，采用卡諾1固定液配合冬青油透明較為合適，且從表3中的透明率可以看出，適當延長固定和透明的時間有助于提高此種方法的透明率。

2.3 不同處理方法的透明效果

根據(jù)前述試驗結(jié)論，冬青油作為透明劑在各個固定液組合中效果好，且透明率較為穩(wěn)定，尤其是高倍鏡下觀察時優(yōu)勢突出。本試驗觀察懸鈴葉苧麻雌花發(fā)育各階段的胚胎，對大孢子母細胞時期等相對較小的材料鏡檢時有較高要求，故選用冬青油作為透明劑。圖1中各圖為不同固定液配合冬青油透明時的微分干涉差顯微鏡鏡檢照片。A：卡諾1固定，冬青油透明；B：卡諾2固定，冬青油透明；C：卡諾3固定，冬青油透明；D：FPA50固定，冬青油透明。比較各圖的透明效果可以看出，圖A脫色效果好、清晰度高、立體感強，圖B、C、D則依次存在細胞結(jié)構(gòu)被破壞、內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰、脫色效果差等不足。

圖1 不同固定液固定胚珠的透明效果（透明劑均為冬青油）Figure 1 The clearingeffects ofdifferent fixingsolutions(transparent solution was methyl salicylate)

2.4 懸鈴葉苧麻雌花胚胎發(fā)育的鏡檢結(jié)果

選用卡諾1固定液固定，配合冬青油透明的方法，對懸鈴葉苧麻的雌花進行整體透明，觀察胚胎的發(fā)育情況。鏡檢結(jié)果的照片見圖2。

3 討論

整體透明的核心步驟是固定和透明，固定使樣品組織停止分裂并保持其活體狀態(tài)，透明使之內(nèi)部組織折射率不同便于顯微鏡觀察，這在單子葉植物的胚胎和子房觀察中已經(jīng)取得了不錯的效果[8-11]。近年來也有新方法不用固定，將胚珠懸浮在硅油中，通過電影攝影術(shù)對活胚囊進行觀察，但這種方法往往對珠心和珠被的透明不足，所以未能普及。因此，本研究采用的卡諾1固定液配合冬青油觀察懸鈴葉苧麻雌花胚胎的整體透明技術(shù)仍然擁有顯著技術(shù)優(yōu)勢[12]。卡諾1固定液的脫色效果好，能最大限度的保存胚珠內(nèi)部結(jié)構(gòu)不破壞，配合選用的3種透明劑均有較理想的透明效果和較高的透明率，其中以冬青油作為透明劑的效果最好。本研究表明，整體透明技術(shù)對于胚胎胞原期至成熟期的懸鈴葉苧麻雌花都可以有效觀察，并可以為快速判斷胚胎的發(fā)育階段提供一定的理論支持和試驗基礎(chǔ)。整體透明技術(shù)在對懸鈴葉苧麻雌花的應用中也還存在一定的不足，如透明率偏低、拍攝的照片清晰度不高、對特定時期的胚胎觀察不夠精準等，因此還需要做更多的深入研究。

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