賈婉琪，王玉富，郝冬梅，邱財生，郭 媛，鄧 欣，龍松華，陳信波

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

植物遺傳轉(zhuǎn)化是一項農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，它利用重組DNA與植物組織培養(yǎng)技術(shù)將外源基因?qū)胫参锸荏w細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，使外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)，從而產(chǎn)生人類所需性狀的轉(zhuǎn)基因植株。亞麻作為紡織原料和食用油已經(jīng)具有悠久的歷史，而亞麻種子作為保健食品及醫(yī)藥的深度開發(fā)剛剛開始，同時我國亞麻纖維又嚴(yán)重短缺，亞麻產(chǎn)業(yè)的研究與發(fā)展具有廣闊的前景。

由于在育種中長期使用同一些骨干近緣親本，造成現(xiàn)有品種遺傳基礎(chǔ)狹窄，僅依靠傳統(tǒng)育種手段已無法滿足對優(yōu)良品種的需求，基因工程則為培育優(yōu)良品種開辟了新途徑，其中研究最清楚和應(yīng)用最成功的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在已獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中約80%是由農(nóng)桿菌介導(dǎo)完成的[1]。亞麻轉(zhuǎn)基因始于20世紀(jì)80年代，1983年Hepburn等用根癌農(nóng)桿菌感染亞麻上胚軸得到亞麻腫瘤株系，自此開始了亞麻基因工程的育種研究[2]。1987年Nazir Basiran等報道利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次獲得了亞麻轉(zhuǎn)基因植株。但亞麻在這方面存在著基因轉(zhuǎn)化率較低，基因型依賴性強(qiáng)，再生細(xì)胞部位與轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞部位不一致等亟待解決的問題。對此，筆者對亞麻再生體系的建立、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在亞麻育種上的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了闡述和展望。

1 亞麻再生體系影響因素的研究

建立高效組織培養(yǎng)體系是植物遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件。從理論上說，植物細(xì)胞具有全能性，每一個具有完整細(xì)胞核的植物細(xì)胞，在適宜的條件下都有分化發(fā)育成完整植株的潛力。但在實際應(yīng)用中，亞麻組織的再生受基因型、外植體、培養(yǎng)條件等因素的影響，機(jī)制比較復(fù)雜。

1.1 最佳外植體的選擇

1.1.1 外植體的基因型

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化很大程度上受到外植體基因型的影響。是否具有脫分化和再分化能力，能夠產(chǎn)生創(chuàng)傷信號分子刺激農(nóng)桿菌向植物細(xì)胞運動，并使農(nóng)桿菌vir基因活化和表達(dá)等，都和植物的基因型有直接關(guān)系。

姬妍茹等[14]以雙亞五號和雙亞七號為試驗材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，在完全空白對照中，亞麻下胚軸的分化率高達(dá)89.1%和93.6%；而經(jīng)農(nóng)桿菌處理后，其分化率表現(xiàn)出較大差異，雙亞五號分化率最高能夠達(dá)到23.4%，雙亞七號僅為5.56%。在Caillot等[5]的研究中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，品種Barbara和Oliver的愈傷誘導(dǎo)率卻有明顯差異，分別為52.3%和93%。同樣Belonogova和Raldugina[4]在以萌發(fā)5天的亞麻子葉作為外植體的高頻再生體系的研究中發(fā)現(xiàn)，品種A-29的不定芽分化頻率是Alexim的三倍。

1.1.2 無菌苗的獲得

獲得無菌苗和相應(yīng)的外植體是建立離體再生系統(tǒng)的第一步，在有關(guān)亞麻的文獻(xiàn)中，對亞麻的消毒方法也是大同小異。姬妍茹等[40]在用組織培養(yǎng)法繁殖野生亞麻時，將野生亞麻種子播于花盆，待幼苗長至20cm具有很多分枝后，取3cm的小分枝，用0.2%NaClO滅菌5min。

在亞麻種子消毒方面，國外研究者[3～11]多采用含次氯酸鈉的漂白劑浸泡20min～40min以達(dá)到對亞麻種子消毒的目的。在一定范圍內(nèi)，隨著漂白劑使用濃度和溫度的提高，亞麻下胚軸外植體的再生能力、實生苗的生存和生長能力是逐漸降低的，最佳的消毒方法是在10℃下使用濃度為40%的漂白劑（含5%NaClO）浸泡20min[12]。國內(nèi)研究者常采用的是短時間的乙醇消毒和長時間的升汞消毒，70%～75%乙醇消毒30s～5min后用0.1%升汞消毒3min～15min。筆者在試驗中也發(fā)現(xiàn)，不同品種亞麻所需要的消毒時間有很大差異，這可能與其帶菌程度不同有關(guān)，為保證種子出苗率，應(yīng)在徹底消毒的基礎(chǔ)上盡量縮短升汞浸泡時間。不論使用何種消毒試劑，消毒后都必須用無菌水進(jìn)行充分的漂洗。

1.1.3 苗齡

外植體的取材也是影響組培成功的關(guān)鍵因素，一般情況下，春季接種的實生苗其生活能力和再生能力都比較好。焦德志等[35]培養(yǎng)雙亞6號時，切取苗齡15天的實生苗的子葉和下胚軸作為外植體。Belonogova和Raldugina[4]在試驗中發(fā)現(xiàn)采用萌發(fā)5天的亞麻子葉作為外植體其分化與再生能力要遠(yuǎn)高于萌發(fā)8天之后的。

對于最常用的外植體--下胚軸的取材時間，張志揚(yáng)等[34]發(fā)現(xiàn)隨著苗齡的增加，其不定芽誘導(dǎo)率和平均出芽數(shù)呈下降趨勢，7～10天苗齡的下胚軸最適于不定芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率達(dá)91%～97%，平均出芽數(shù)達(dá)11.43個，是取材的最佳時期。這一結(jié)果與Yildiz和?zgen[3]、Beranová等[21]、康慶華等[24]、王毓美等[28]的試驗結(jié)果是一致的。

1.1.4 外植體類型

在已報道的亞麻組織培養(yǎng)相關(guān)文獻(xiàn)中，主要選擇的外植體有，子葉、下胚軸、莖尖、花粉等。焦德志等[35]將實生苗上切取的子葉（去掉基部）和下胚軸（0.8cm）進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示子葉誘導(dǎo)愈傷組織比下胚軸快；培養(yǎng)10天后子葉周圍開始形成愈傷，而下胚軸通常在一端形成較多的愈傷組織，表現(xiàn)出一定的極性和不平衡性。姬妍茹等[14]的試驗結(jié)果表明，外植體培養(yǎng)一周的成活率由高到低的順序為子葉塊、下胚軸段、莖尖。子葉塊雖然有著最高的GUS瞬時表達(dá)率和成活率，但經(jīng)農(nóng)桿菌處理后其分化頻率極低；莖尖的分化率也較低，而下胚軸分化率較高，因此后續(xù)試驗中將下胚軸作為轉(zhuǎn)化的外植體。胚軸的不同部位分化率也不同，Ishikawa等[39]將萌發(fā)后的亞麻種子幼苗去掉頂端的胚軸分成上中下三部分，統(tǒng)計其不定芽分化率分別為10%、30%、60%。

下胚軸作為轉(zhuǎn)化時最常用的外植體，具有在切斷或脅迫條件下形成不定芽的獨特能力（在下胚軸切段的整個表皮細(xì)胞都產(chǎn)生不定芽）。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞通常只在兩端的創(chuàng)口處產(chǎn)生，因此在遺傳轉(zhuǎn)化時形成過多的嵌合芽是下胚軸作為外植體的缺點[4]。

1.1.5 預(yù)處理

Zhan等[17]在研究中發(fā)現(xiàn)增加表皮創(chuàng)傷有助于轉(zhuǎn)化、能夠促進(jìn)愈傷的形成但卻抑制芽的分化。Dong和McHughen[7]將下胚軸剝皮處理再預(yù)培養(yǎng)2～3天，經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染、共培養(yǎng)后對其進(jìn)行GUS染色，發(fā)現(xiàn)下胚軸表面被轉(zhuǎn)化組織覆蓋的區(qū)域與對照相比有明顯增加。Yildiz和?zgen[3]將三個不同亞麻品種的下胚軸轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基之前先用無菌水浸泡20min，結(jié)果顯示在后期培養(yǎng)中外植體的干重、鮮重、不定芽分化率、生根率等與未作水處理的相比都有顯著的提高。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是外植體賴以生長的物質(zhì)基礎(chǔ)，不同組分的培養(yǎng)基和不同比例激素的添加都會產(chǎn)生不同的效果。筆者對國內(nèi)外亞麻再生系統(tǒng)的培養(yǎng)基做了如下統(tǒng)計，以供今后的相關(guān)研究進(jìn)行參考。

表1 亞麻組織培養(yǎng)再生體系培養(yǎng)基的研究Tab.1 The research on the mediumofregeneration systemin flaxtissue culture

?

此外，王玉富等[23]在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因的培養(yǎng)基研究中發(fā)現(xiàn)，作為基本培養(yǎng)基B5培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比更不利于脫菌。

培養(yǎng)基中添加不同的凝固劑對篩選劑卡那霉素的應(yīng)用效果也不同。在亞麻組織培養(yǎng)中，外植體在植物凝膠（Phytagel）中的生長狀態(tài)要優(yōu)于瓊脂凝膠（Agargel）優(yōu)于瓊脂（Bacto Agar）。因此在遺傳轉(zhuǎn)化中使用瓊脂作為凝固劑時50mg/l的卡那霉素即可發(fā)揮篩選抗性愈傷的作用，使用瓊脂凝膠要添加100mg/l的卡那霉素，而植物凝膠需200mg/l的卡那霉素才能達(dá)到篩選的目的[36]。

很多文獻(xiàn)中報道，培養(yǎng)基中加入活性炭對培養(yǎng)物的生長分化有促進(jìn)作用，它可以吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)。張志揚(yáng)[41]在研究中發(fā)現(xiàn)，在不定芽誘導(dǎo)過程中添加1.5g/l的活性炭，可提高健康不定芽的誘導(dǎo)頻率，但在生根時添加活性炭卻得到相反的效果。王秀珍[32]建議活性炭的用量在0.5%～3%之間，因為使用量過高會削弱瓊脂的凝固力。

1.3 光強(qiáng)

Caillot等[5]專門對光照的影響做了研究，培養(yǎng)初期使用HL（高光強(qiáng)）能顯著提高下胚軸兩端切口處愈傷的形成能力和器官分化能力，而且還對愈傷分化出芽有積極的作用，在此條件下每個愈傷分化出2.7個抗性不定芽，相對的在LL（低光強(qiáng)）下只有1.9個不定芽產(chǎn)生。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻遺傳轉(zhuǎn)化的研究

已用于亞麻遺傳轉(zhuǎn)化的外源基因有：胭脂堿合成酶基因(nos)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因（npt-Ⅱ)、乙酰乳酸合成酶基因（als）、5烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因（epsps）、β-葡糖醛酸酶基因（gus）、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）、壯觀霉素抗性基因（aadA)、磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（pmi）、綠色熒光蛋白基因（gfp)、幾丁質(zhì)酶基因（rc24）、兔防御素基因(np-Ⅰ)、β-1，3-葡聚糖基因及L6、M、N銹病抗性基因、bar基因等。

與其它方法相比，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有操作簡便、不需特殊的儀器、培養(yǎng)周期較短等特點，更重要的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入的基因經(jīng)常是單拷貝，因而表達(dá)水平高，并且可以轉(zhuǎn)入大的DNA片段，因此對于大多數(shù)植物的轉(zhuǎn)化工作而言是首先考慮的方法。

2.1 農(nóng)桿菌種類對轉(zhuǎn)化的影響

遺傳轉(zhuǎn)化中常用的農(nóng)桿菌菌株主要分為3種不同類型，章魚堿型（如LBA4404）、胭脂堿型（如C58）和農(nóng)桿堿型（如EHA105)。在通常的遺傳轉(zhuǎn)化操作中，胭脂堿型和農(nóng)桿堿型因易于操作而常被作為首選[13]。在亞麻上應(yīng)用過的菌株有 AGL1[14,15]、GV3850[6]、A208[8]、GV3101[5,9,11,15]、PGV2260[16]、C58C1[7,10,17,18]、LBA4404[6,19,20～22]和EHA105[23,24]等。張志揚(yáng)[41]將兩種農(nóng)桿菌菌株對亞麻白花品種的侵染效果做了比較，結(jié)果顯示，EHA105浸染后的愈傷誘導(dǎo)率和抗性不定芽誘導(dǎo)率明顯高于LBA4404。農(nóng)桿菌菌株的浸染能力在應(yīng)用于不同類型植株時有很大差異，因而不同的作物種類在實際操作過程中存在最合適或最敏感菌株，選擇受體植物敏感的菌株是轉(zhuǎn)化成功的重要因素。

2.2 浸染濃度與浸染時間對轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌菌液濃度過低會因外植體上附著的菌體較少而降低農(nóng)桿菌的侵入，濃度過高又會對外植體造成傷害，且在后續(xù)培養(yǎng)中很難控制農(nóng)桿菌的污染；浸染時間長短對外植體的影響也是如此。因此對于不同的亞麻品種篩選出最優(yōu)浸染濃度與浸染時間方案是提高轉(zhuǎn)化頻率的關(guān)鍵。姬妍茹等[14]、王玉富等[23]、康慶華等[24]及Bretagne-Sagnard等[25]在試驗中均采用OD600=0.5的菌液，但浸染時間有所不同，分別為3～5min、10～20min、30min和1h。國外研究者采用OD600=0.4～0.8，浸染時間2h的居多[5,21]；但亦有浸染時間僅為5秒的[27]。張志揚(yáng)[41]對不同濃度菌液的浸染效率做了比較，結(jié)果顯示OD600=0.6、浸染時間為30min時，亞麻抗性不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到26.67%，遠(yuǎn)高于其他組合。

2.3 預(yù)培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化的影響

一般認(rèn)為，在農(nóng)桿菌浸染前對外植體進(jìn)行一段時間的預(yù)培養(yǎng)，可以減輕傷害脅迫，調(diào)整細(xì)胞生理狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞分裂，更易整合外源DNA，有利于提高轉(zhuǎn)化效率。還有研究認(rèn)為預(yù)培養(yǎng)提高轉(zhuǎn)化效率另一方面的原因是可以便于外植體傷口酚類物質(zhì)的釋放和積累，這種酚類物質(zhì)可促進(jìn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。但預(yù)培養(yǎng)時間過長會使傷口愈合，反而不利于T-DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞。

姬妍茹等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)與否直接影響著受體的一周成活率，外植體下胚軸和子葉的GUS瞬時表達(dá)率在預(yù)培養(yǎng)2天后開始出現(xiàn)下降趨勢，不進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)雖然有100%的GUS瞬時表達(dá)，但外植體生長狀態(tài)不佳，成活率低，難于進(jìn)行再分化。在Dong和McHughen[7]的試驗研究中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的下胚軸切口兩端有較強(qiáng)的染色效果，預(yù)培養(yǎng)時間超過6天的染色強(qiáng)度反而降低。Bretagne-Sagnard和Chupeau[25]在GUS染色試驗的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)和剝皮同樣能夠使瞬時轉(zhuǎn)化率提高；剝皮處理后，藍(lán)色表達(dá)細(xì)胞不止在兩端，還在整個受創(chuàng)表皮出現(xiàn)，但最終獲得的轉(zhuǎn)化率并沒有提高，依然為15%。

2.4 共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響

共培養(yǎng)是T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的過程，共培養(yǎng)時間的長短關(guān)系到T-DNA片段向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程是否能夠完成，前人研究表明，T-DNA向植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移需要16～24h，因此共培養(yǎng)時間至少應(yīng)在1天以上。在亞麻轉(zhuǎn)化過程中最常用的共培養(yǎng)時間為2～4天[5,6,8,9,14,16,18,21～23,25～29]。Dong和McHughen[7]將共培養(yǎng)時間從2～3天延長到5～7天，檢測GUS基因的瞬時表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化頻率有很大程度的提高，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的分布范圍也擴(kuò)大了。張志揚(yáng)[41]在試驗中比較了不同共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果顯示，隨共培養(yǎng)時間的延長，轉(zhuǎn)化頻率升高，但共培養(yǎng)超過72h后，農(nóng)桿菌的過度增殖給下胚軸帶來的毒害作用也增強(qiáng)，污染的下胚軸數(shù)增加，綜合考慮96h為最佳共培養(yǎng)時間。針對不同的研究，具體共培養(yǎng)時間依品種基因型和菌液濃度等而定。

2.5 乙酰丁香酮與芥子酸對轉(zhuǎn)化的影響

乙酰丁香酮（AS）是農(nóng)桿菌寄主植物受傷后分泌的酚類化合物之一，其作用是活化Ti質(zhì)粒 Vir區(qū)基因，是促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素?？祽c華等[24]認(rèn)為菌液中添加50mg/l的AS即可。王毓美等[28]在試驗中向搖好的農(nóng)桿菌菌液中添加100mg/l AS后繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12～16h，然后再浸染下胚軸，這與李學(xué)寶等[16]、袁朝興等[19]的研究結(jié)果相同。

Zhan等[17]向培養(yǎng)基中添加100～200μM芥子酸（sinapinic acid），目的同樣是活化Ti質(zhì)粒Vir區(qū)，最大程度的提高轉(zhuǎn)化效率，使沒有創(chuàng)口的表皮細(xì)胞也可以被轉(zhuǎn)化，但結(jié)果顯示最終轉(zhuǎn)化率并沒有明顯變化。

2.6 選擇標(biāo)記

篩選劑是準(zhǔn)確、有效的區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的必不可少的條件，其種類及使用濃度需通過研究具體確定。在進(jìn)行亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化時，選擇抗生素使用較多的是卡那霉素，使用濃度在50～200mg/l之間[10,16,17,19,21,22,24,28～31]；潮霉素的使用范圍在 30～50mg/l[9,15,26,31]；慶大霉素 50mg/l[32]；巴龍霉素100mg/l[5]；G418 50mg/l[5]；壯觀霉素 40mg/l[15]。

Bretagne-Sagnard和Chupeau[25]對亞麻遺傳轉(zhuǎn)化時篩選抗生素的應(yīng)用效果做了比較，同一處理下卡那霉素100mg/l、G418 100mg/l、巴龍霉素200mg/l的篩選效果相同；壯觀霉素使用濃度在100mg/l時外植體表面依然有芽的分化，但全部為漂白色，當(dāng)濃度達(dá)到400mg/l以上時則完全不能分化出芽?？股氐倪x擇不僅與外植體的基因型有關(guān)，還受農(nóng)桿菌菌株類型和外植體生長階段不同的影響，在與農(nóng)桿菌C58C1共培養(yǎng)下，巴龍霉素和G418篩選的外植體不能形成不定芽，卡那霉素篩選雖然可產(chǎn)生不定芽，但無法誘導(dǎo)生根；與AGL1菌株共培養(yǎng)，在下胚軸兩端切口處產(chǎn)生抗性不定芽，在壯觀霉素濃度為100mg/l時抗性芽可生根。

除抗生素外，還有研究者使用草甘膦（gly）1μM[8]，氯磺?。╟hlorsulfuron）400nM[18]作為篩選劑。Lamblin等[11]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（PMI）轉(zhuǎn)入亞麻品種Barbara中，初選時用10g/l甘露糖+20g/l蔗糖代替30g/l蔗糖，繼代和生根時用附加2.5g/l甘露糖的培養(yǎng)基篩選，最終獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

2.7 農(nóng)桿菌抑菌劑

選擇適宜的能在受體材料與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)之后抑制農(nóng)桿菌生長的除菌抑制劑也是農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的重要步驟。最適宜的濃度為既要有效控制農(nóng)桿菌過度生長又要對轉(zhuǎn)化體的抑制作用最小。亞麻上常用的除菌抗生素有Cef(頭孢類）、Amp（氨芐類）、Carb（羧芐類）和Timentin（克拉維酸），這些抗生素對農(nóng)桿菌都有殺菌和抑制的作用，對植物細(xì)胞也有一定的生物效應(yīng)，通常在濃度為500mg/l以下時對外植體的生長和分化沒有明顯的影響，亦是最常使用的濃度[5,6,9,11,17,19,26,28]。也有兩種抗生素混用達(dá)到較好抑菌效果的報道[8,16,18,21,27,29]?？祽c華等[24]在亞麻轉(zhuǎn)基因抗生素效果的研究中發(fā)現(xiàn)，在選擇培養(yǎng)基內(nèi)加入500mg/l克拉維酸鉀和200mg/l頭孢噻肟（進(jìn)口）的抗菌素來取代500mg/l頭孢噻肟（國產(chǎn)）不僅脫菌效果徹底“期效長”且不影響亞麻愈傷形成和芽的分化。姬妍茹等[42]發(fā)現(xiàn)在抑制農(nóng)桿菌菌株AGL1時，頭孢塞污鈉效果最好，頭孢曲松鈉次之，有效抑菌濃度分別為200mg/l和300mg/l，此濃度下雙亞5號下胚軸不定芽分化率分別為93.6%和91.3%。

3 存在的問題與展望

經(jīng)過多年的研究，在亞麻的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面已經(jīng)取得了令人鼓舞的成績。亞麻組織培養(yǎng)再生體系已經(jīng)比較完善，但并不是所有的組培再生體系都適合做遺傳轉(zhuǎn)化體系，良好的基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)具有高效穩(wěn)定的再生能力。賈士榮[33]認(rèn)為，用于轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)應(yīng)具有80%～90%以上的再生頻率，并且每個外植體上必須再生叢生芽，且芽數(shù)量越多越好，這樣才有獲得高頻轉(zhuǎn)化的可能；此外還需具有穩(wěn)定的外植體來源，即用于轉(zhuǎn)化的受體要易于得到，且可大量供應(yīng)。由此可見，以亞麻下胚軸為外植體建立的再生系統(tǒng)是較理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。但亞麻下胚軸具有在脅迫或切斷時在整個表皮都形成不定芽的獨特能力，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞通常只在兩端的創(chuàng)口處產(chǎn)生，因此在遺傳轉(zhuǎn)化時形成過多的嵌合芽是下胚軸作為外植體的缺點[4]。如何在提高抗性叢生芽數(shù)量的基礎(chǔ)上減少無用嵌合芽的產(chǎn)生，是亞麻再生體系今后需要重點研究解決的問題。

在亞麻的遺傳轉(zhuǎn)化方面，主要問題是轉(zhuǎn)化率低，外源基因表達(dá)強(qiáng)度不夠，原因可能有以下幾個方面：一是篩選劑加的太少或太遲，篩選時間不夠，致使非轉(zhuǎn)化細(xì)胞分裂分化；二是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活率較低，且這些僅有的少數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠保護(hù)大量的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，使之不受篩選劑的作用，導(dǎo)致分化出苗，發(fā)生“逃逸”現(xiàn)象；三是在長時間的轉(zhuǎn)化和篩選培養(yǎng)過程中，亞麻對篩選劑產(chǎn)生抗性以及實驗的污染等問題使轉(zhuǎn)化率下降。因此仍然需要對轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行深入研究。

相信隨著植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷成熟，這些問題將逐步得到解決。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻轉(zhuǎn)基因體系必將在育種工作中發(fā)揮越來越重要的作用。

[1] 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[2] 李仕金,辛培堯,周軍.我國麻類作物基因工程育種研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2009,8:105-109.

[3] Yildiz M,?zgen M.The Effect of a Submersion Pretreatment on In Vitro Explant Growth and Shoot Regeneration from Hypocotyls of Flax(Linumusitatissimum)[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2004,77:111-115.

[4] Belonogova MA,Raldugina GN.Shoot Regeneration fromCotyledon Explants of Fibre Flax(Linumusitatissimum)and their subsequent rooting[J].Russian Journal ofPlant Physiology,2006,53(4):501-506.

[5]Caillot S,Rosiau E,Laplace C,et al.Influence oflight intensityand selection scheme on regeneration time oftransgenic flaxplants[J].Plant Cell Reports,2009,28:359-371.

[6] Zhan Xiangcan,Jones D A,Kerr A.The pTiC58 tzs gene promotes high-efficiency root induction by agropine strain 1855 of A-grobacteriumrhizogenes[J].Plant Molecular Biology,1990,14:785-792.

[7] Dong Jinzhuo,McHughen A.Patterns of transformation intensity on flax hypocotyls inoculated with Agrobacterium tumefaciens[J].Plant Cell Reports,1991,10:555-560.

[8] Jordan MC,McHughen A.Glyphosate tolerant flaxplants fromAgrobacteriummediated gene transfer[J].Plant Cell Reports,1988,7:281-284.

[9]Rakouskuy S,Tejklová E,Wiesner L,et al.Hygromycin B-an alternative in flaxtransformant selection[J].Biologia Plantarum,1999,42(3):361-369.

[10] Basiran N,Armitage P,Scott R J,et al.Genetic transformation offlax(Linum usitatissimum)byagrobacteriumtumefaciens:Regeneration oftransformed shoots via a callus phase[J].Plant Cell Reports,1987,6:396-399.

[11]Lamblin F,Aimé A,HanoC,et al.The use ofthe phosphomannose isomerase gene as alternative selectable marker for Agrobacterium-mediated transformation offlax(Linumusitatissimum)[J].Plant Cell Reports,2007,26:765-772.

[12] Yildiz M,Er C.The effect of sodium hypochlorite solutions on in vitro seedling growth and shoot regeneration of flax(Linum usitatissimum)[J].Naturwissenschaften,2002,89:259-261.

[13] 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社,1997.

[14] 姬研茹,趙軍,劉偉偉,等.應(yīng)用直接分化再生系統(tǒng)進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究[J].生物技術(shù)通報,2008,1:128-132.

[15] Chen Yurong,Singh S,Rashid K,et al.Pyramiding of alleles with different rust resistance specificities in Linum usitatissimum L.[J].Mol Breeding,2008,21:419-430.

[16] 李學(xué)寶,陳光榮,金波.亞麻下胚軸離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化的研究[J].武漢植物學(xué)研究,1995,13(4):344-348.[17]Zhan Xiangcan,Jones DA,Kerr A.Regeneration offlaxplants transformed byAgrobacteriumrhizogenes[J].Plant Molecular Biology,1988,11:551-559.

[18] McHughen A.Agrobacteriummediated transfer of chlorsulfuron resistance tocommercial flaxcultivars[J].Plant Cell Reports,1989,8:445-449.

[19] 袁朝興,白永庭.亞麻下胚軸轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立[J].植物生理學(xué)報,1993,19(4):378-390.

[20] 苑志輝.兔防御素基因NP-1在亞麻抗枯萎病方面的研究[D].中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[21] Beranová M,Rakousky S,Vávrová Z,et al.Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiencyin flax(LinumusitatissimumL.)[J].Plant Cell Tiss Organ Cult,2008,94:253-259.

[22] Mlynárová L,Bauer M,Nap J P,et al.High efficiencyAgrobacterium-mediated gene transfer toflax[J].Plant Cell Reports,1994,13:282-285.

[23] 王玉富,周思君,劉燕,等.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因的培養(yǎng)基研究[J].中國麻作,2000,22(1):14-16.

[24] 康慶華.亞麻轉(zhuǎn)基因中抗生素應(yīng)用效果的研究[J].中國麻業(yè),2005,27(2):94-97.

[25] Bretagne-Sagnard B,Chupeau Y.Selection oftransgenic flaxplants is facilitated byspectinomycin[J].Transgenic Research,1996,5:131-137.

[26] 李博,黃麗華,蔣向,等.薤白EPSP基因?qū)喡榈霓D(zhuǎn)化及檢測[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,36（1）:12-16.

[27] Jordan MC,McHughen A.Transformed callus does not necessarily regenerate transformed shoots[J].Plant Cell Reports,1988b,7:285-287.

[28] 王毓美,徐云遠(yuǎn),賈敬芬.亞麻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲难芯縖J].西北植物學(xué)報,2000,20(3):346-351.

[29] Drexler H H S,Scheffler J A,Heinz E.Evaluation of putative seed-specific promoters for Linumusitatissimum[J].Molecular Breeding,2003,11:149-158.

[30] 王玉富,康慶華,李希臣,等.亞麻抗除草劑轉(zhuǎn)基因的分子檢測[J].中國麻業(yè)科學(xué),2008,30(1):13-16.

[31] Roberts MR,Kumar A,Scott R,et al.Excision of the maize transposable element Ac in flaxcallus[J].Plant Cell Reports,1990,9:406-409.

[32] 王秀珍.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的月見草Δ-6脂肪酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)化亞麻的研究[D].內(nèi)蒙古大學(xué),2010.

[33] 賈士榮,曹冬孫.轉(zhuǎn)基因植物[J].植物學(xué)通報1992,9(2):3-15.

[34] 張志揚(yáng),陳信波,張瑜,等.亞麻組織培養(yǎng)高頻不定芽誘導(dǎo)體系[J].植物學(xué)通報,2007,24(5):629-635.

[35] 焦德志,李波,呂建偉,等.亞麻愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基的篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(6):1124-1125,1129.

[36] Laine E,Lamblin F,LacouxJ,et al.Gellingagent influences the detrimental effect of kanamycin on adventitious budding in flax[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2000,63:77-80.

[37] 苑志輝,孫洪濤,吳昌斌,等.亞麻體細(xì)胞無性系的建立及其植株再生[J].中國麻作,1997,19(1):17-18,32.

[38] Bretagne B,Chupeau M-C,Chupeau Y,et al.Improved flaxregeneration fromhypocotyls usingthidiazuron as a cytokinin source[J].Plant Cell Reports,1994,14:120-124.

[39] Ishikawa K,Kamada H,Harada H.Another Evidence for Inhibitory Effect of Auxin in Adventitious Bud Formation of Decapitated Flax(Linum usitatissimum L.)seedlings[J].Journal ofPlant Research,1997,110:387-392.

[40] 姬研茹,田玉杰,苑志輝,等.用組織培養(yǎng)法繁殖野生亞麻的研究[J].中國麻業(yè),2001,23(4):8-11.

[41] 張志揚(yáng).亞麻組織培養(yǎng)及高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[42] 姬妍茹,劉偉偉,關(guān)向軍等.農(nóng)桿菌菌株AGL-1抑菌劑的抑菌效果及其對纖維亞麻下胚軸不定芽分化率的影響 [J].中國麻業(yè)科學(xué),2008,30(5):252-255.