馬潔，周召鋒，徐晤，張超群，張卓琦，王志榮

心肌梗死是當(dāng)今社會(huì)威脅人類健康，致死致殘的主要原因，其傳統(tǒng)治療方法如溶栓、血管成形術(shù)、外科搭橋術(shù)都有相應(yīng)的局限性［1］。慢性冠狀動(dòng)脈閉塞已經(jīng)展示了對側(cè)支動(dòng)脈發(fā)展的誘導(dǎo)，其重建使得主要血流通過微血管或血管再生流向?yàn)l死心肌。近十幾年來研究發(fā)現(xiàn)白藜三醇具有抗炎、抗氧化及明確的心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，包括縮小梗死面積［2］。白藜三醇是一種黃體酮類多酚單體化合物，它能否促進(jìn)血管生成尚不清楚。本研究擬建立兔心肌梗死模型，觀察白藜三醇慢性給藥對心肌梗死后血管新生、冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)形成、梗死面積的影響，并進(jìn)一步探討其作用及機(jī)制。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:我們于2010-03至2010-08選擇新西蘭大耳白兔(雌雄不拘)32只，體重(2500±50)g，由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。試劑:白藜三醇(湖南洪江華光生物有限責(zé)任公司)，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和細(xì)胞表面的唾液粘蛋白(CD34)一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)一抗(美國，millipore公司)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(美國，promega公司)，免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型的建立:32只新西蘭白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、手術(shù)對照組、白藜三醇組、消心痛組，每組8只。假手術(shù)組中左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)僅穿線不結(jié)扎，其余三組兔于左心房下緣1～2cm處結(jié)扎左前降支建立急性心肌梗死模型，術(shù)后青霉素鈉80萬單位肌注3天。

術(shù)后藥物干預(yù)及取材:假手術(shù)組及手術(shù)對照組予7%酒精3ml，白藜三醇組予白藜三醇3mg/kg(溶于7%酒精3ml)，消心痛組予消心痛2.4mg/kg(溶于7%酒精3ml)，均灌胃，1次/天。2周后，取存活兔心臟，石蠟包埋、切片;留取梗死邊緣區(qū)組織－80℃保存。

指標(biāo)檢測:4組白兔均經(jīng)以下5種指標(biāo)檢測，①蘇木精—伊紅染色法(HE染色)及馬松三色染色法(Masson染色)檢測梗死區(qū)、非梗死區(qū)心肌病理變化:應(yīng)用image pro plus 6.0圖像分析軟件，參照 Litwin等［3］的方法計(jì)算心肌梗死面積。②梗死邊緣區(qū)微血管密度的檢測:梗死周邊2mm界定為梗死邊緣區(qū)［2］。免疫組化法檢測梗死邊緣區(qū)CD34抗原，采用文獻(xiàn)中所述方法［4］，以 CD34標(biāo)記計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)。③免疫組化化學(xué)染色定量分析各組梗死邊緣區(qū)微血管密度及IGF-1、bFGF的表達(dá):將IGF-1及bFGF染色后的切片，應(yīng)用顯微鏡在相同光源強(qiáng)度下，于400×視野每張切片隨機(jī)選取梗死邊緣區(qū)5個(gè)視野的圖像，待資料匯總后，通過image pro plus圖像分析軟件檢測其平均光密度值(optical density，OD)。④western-blot測定各組梗死邊緣區(qū)心肌IGF-1、b FGF、VEGF-A的蛋白表達(dá):以每個(gè)樣品的總蛋白為100 μg上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，一抗(IGF-11∶100，b-FGF 1 ∶50，VEGF-A 1 ∶1000)封閉 4℃過夜，二抗(1∶100)37℃孵育1 h，紅外熒光顯色。ImageJ圖像分析儀進(jìn)行半定量分析。⑤RT-PCR測定各組梗死邊緣區(qū)VEGF-A的mRNA的表達(dá):以GeneBank中目的基因序列為模板設(shè)計(jì)引物，序列如下:VEGF-A上游引物5’GGG CTC ATG GAC GGG TGA GG3’，下游引物5’TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC3’;β-actin 上游引物5’CTA CGA GGG CTA CGC GCT GC3’，下游引物5’CGA GAG AGG GTG TCC CGC CA3’(引物由上海Invitrogen生物公司合成)。RT反應(yīng)條件:室溫10 min，45℃ 50 min，94℃ 5 min，0℃ 10 min;PCR 反應(yīng)條件:94℃ 5 min 預(yù)變性;94℃ 1 min，57℃ 1 min，68℃1 min共40個(gè)循環(huán);終末延伸68℃ 7 min。取RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物4 μl于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像掃描及分析系統(tǒng)，測定目的基因與內(nèi)參基因的積分吸光度比值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。分別行方差齊性檢驗(yàn)、單因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

一般情況:27只動(dòng)物存活至治療結(jié)束，總存活率為84.4%(27/32)。

手術(shù)對照組，白藜三醇組，消心痛組HE染色及Masson染色:HE染色可見未梗死部位的心肌細(xì)胞排列整齊緊密，肌纖維走向明晰，細(xì)胞分界清楚，胞核橢圓形位于中央，胞質(zhì)呈嗜酸性均勻染色，而梗死區(qū)室壁變薄，外膜至內(nèi)膜間心肌纖維數(shù)量減少，肉芽組織、纖維組織和脂肪組織增生明顯，各種細(xì)胞排列紊亂，少量散在的心肌細(xì)胞。Masson染色梗死部位纖維結(jié)締組織呈藍(lán)色，正常心肌纖維呈紫紅色或深紅色。

心肌梗死面積及梗死邊緣區(qū)微血管密度測算:依據(jù)HE、Masson染色結(jié)果，手術(shù)對照組、白藜三醇組及消心痛組梗死邊緣區(qū)微血管密度較假手術(shù)組明顯增加(P＜0.05)，白藜三醇組及消心痛組較手術(shù)對照組明顯增加(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;白藜三醇組與消心痛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。白藜三醇組及消心痛組心肌梗死面積明顯低于手術(shù)對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而白藜三醇組與消心痛組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(表1)

表1 各組心肌梗死面積及梗死邊緣區(qū)微血管密度比較()

表1 各組心肌梗死面積及梗死邊緣區(qū)微血管密度比較()

注:與假手術(shù)組比較*P＜0.05;與手術(shù)對照組比較△P＜0.05

組別 例數(shù) 心肌梗死面積(%)梗死邊緣區(qū)微血管密度(個(gè))假手術(shù)組8.31±2.51手術(shù)對照組 6 33.81±3.76 13.32±2.75*白藜三醇組 7 22.82±4.10△ 25.15±3.74＊△消心痛組 7 23.08±3.69△ 24.54±2.577 0＊△

VEGF-A、IGF-1及bFGF表達(dá)情況:白藜三醇組、消心痛組較假手術(shù)組、手術(shù)對照組能明顯增加VEGFA(蛋白及mRNA 表達(dá))、IGF-1(OD，蛋白表達(dá))、bFGF(OD，蛋白表達(dá))的表達(dá)(P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;手術(shù)對照組較假手術(shù)組VEGF-A(蛋白及mRNA表達(dá))、IGF-1(OD，蛋白表達(dá))表達(dá)增加(P ＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但bFGF表達(dá)兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);消心痛組IGF-1(OD，蛋白表達(dá))的表達(dá)水平較白藜三醇組明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，VEGF-A、bFGF兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(western-blot與RT-PCR所測VEGF-A結(jié)果相一致;western-blot與免疫組化化學(xué)染色法所測IGF-1、bFGF 結(jié)果相一致)。(圖 1，圖 2，表2)

圖1 各組心肌IGF-1、bFGF蛋白表達(dá) IGF-1:胰島素樣生長因子-1 bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長因子 β-actin:β-肌動(dòng)蛋白。1:假手術(shù)組(7例)2:手術(shù)對照組(6例)3:白藜三醇組(7例)4:消心痛組(7例)

圖2 各組VEGF-A的mRNA及蛋白表達(dá)圖2A為mRNA表達(dá)圖2B為蛋白表達(dá)。VEGF-A:血管內(nèi)皮生長因子-A β-actin:β-肌動(dòng)蛋白 mRNA:信使核糖核酸 DNA marker:脫氧核糖核酸分子標(biāo)記。除手術(shù)對照組樣本數(shù)為6例，其余均為7例

表2 各組梗死邊緣區(qū)胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子-A的表達(dá)量比較()

表2 各組梗死邊緣區(qū)胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子-A的表達(dá)量比較()

注:與假手術(shù)組比較*P＜0.05;與手術(shù)對照組比較△P＜0.05;與白藜三醇組比較▲P＜0.05。IGF-1:胰島素樣生長因子-1 bFGF:堿性成纖維細(xì)胞生長因子 VEGF-A:血管內(nèi)皮生長因子-A OD:光密度值

假手術(shù)組(n=7) 手術(shù)對照組(n=6) 白藜三醇組(n=7) 消心痛組(n=7)IGF-1(OD) 0.0029±0.0030 0.0199±0.0088* 0.1506±0.0557＊△ 0.0829±0.0243＊△▲IGF-1(蛋白表達(dá)) 0.1171±0.0916 0.3701±0.0778* 1.2062±0.2495＊△ 0.6671±0.0716＊△▲bFGF(OD) 0.0082±0.0089 0.0367±0.0464 0.0928±0.0341＊△ 0.0934±0.0459＊△bFGF(蛋白表達(dá)) 0.2884±0.0748 0.4160±0.1481 0.8663±0.1562＊△ 0.8961±0.1075＊△VEGF-A(蛋白表達(dá)) 0.6508±0.0762 0.9225±0.0642* 1.2314±0.0556＊△ 1.2259±0.0752＊△VEGF-A(mRNA表達(dá)) 0.5491±0.0171 0.7452±0.0361* 1.0169±0.0604＊△ 0.8898±0.0419＊△

3 討論

臨床研究證明，靠機(jī)體啟動(dòng)再生新的血管以適應(yīng)缺血變化的過程非常緩慢，因此，在血管成形術(shù)、外科搭橋術(shù)不能奏效的時(shí)候，人為地增加心肌局部生長因子的濃度，對緩解以致解除心肌缺血有潛在的可行性。有人在大鼠的心肌及后肢肌缺血等模型中，應(yīng)用生長因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療，結(jié)果表明，缺血的骨骼肌可建立大量的側(cè)支循環(huán);在心肌中，微血管密度增加，引起冠狀動(dòng)脈血流量的增加，梗死面積的顯著縮小及心功能的明顯改善。心肌梗死后冠狀動(dòng)脈原有側(cè)支開放的程度有限，不足以代償機(jī)體的需要，而血管新生促側(cè)支循環(huán)形成則有重要意義。良好的側(cè)支循環(huán)在減少心肌缺血和梗死的范圍、保護(hù)存活心肌、抑制心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌重構(gòu)和心功能有著積極的作用。我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，消心痛和白藜三醇均可以開通急性心肌梗死的側(cè)支循環(huán)。

消心痛作為硝酸酯類藥物是外源性一氧化氮供體，其作為臨床上對冠心病患者傳統(tǒng)藥物的應(yīng)用，能明顯改善患者心肌缺血的癥狀。既往有許多研究表明，新生血管的形成與一氧化氮合酶—一氧化氮系統(tǒng)的關(guān)系密切。有研究表明eNOS轉(zhuǎn)基因治療可減少大鼠心肌梗死的面積，其機(jī)制可能與激活TGF-β/Samd2信號通路、增加血管生成有關(guān)［5］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，兔急性心肌梗死后，消心痛喂養(yǎng)兩周可明顯減少心肌梗死面積，增加心肌缺血區(qū)微血管的密度，其機(jī)制可能涉及消心痛體內(nèi)轉(zhuǎn)化為一氧化氮，促進(jìn)多種生長因子的直接或間接表達(dá)增加。

范虞琪［6］報(bào)道了白藜三醇對動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防作用及直接擴(kuò)張血管作用。Kaga等［2］研究發(fā)現(xiàn)白藜三醇在體外試驗(yàn)中可促進(jìn)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔形態(tài)，在活體試驗(yàn)中給予白藜三醇預(yù)處理可減少大鼠心肌梗死面積。有個(gè)別報(bào)道證實(shí)白藜三醇在心肌缺血再灌注方面保護(hù)心臟［7］。諸多研究證實(shí)，白藜三醇是一個(gè)有希望抵抗冠心病，多方面保護(hù)心臟的物質(zhì)。本文首先建立兔心肌梗死模型，然后予包括白藜三醇等不同的藥物干預(yù)，兩周后證實(shí)心肌梗死后應(yīng)用白藜三醇可以減少心肌梗死面積，增加微血管密度，誘導(dǎo)心肌梗死后IGF-1、bFGF、VEGF-A的表達(dá)，且與手術(shù)對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，IGF-1差異最為顯著，較消心痛組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其機(jī)制可能與硝酸脂類促血管生成作用有所不同。近年來對IGF-1的研究提示，IGF-1對內(nèi)皮功能的改善可以通過與內(nèi)皮存在高親和力位點(diǎn)并與之相互作用產(chǎn)生一氧化氮［8］并通過抗細(xì)胞凋亡和抗炎作用來抵抗內(nèi)皮功能障礙。通過介導(dǎo)血管舒張［9］來調(diào)整血管緊張度和動(dòng)脈血壓，同時(shí)保存冠狀動(dòng)脈血流儲備［10］。在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞上，IGF-1可以通過酪氨酸激酶膜受體與胰島素受體1和2的結(jié)合并相互作用增加一氧化氮合酶的活性［11］，并持續(xù)、緩慢釋放一氧化氮，增加血管舒張。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1能提高缺血的預(yù)處理，并通過其抗細(xì)胞凋亡和鉀離子通道的開放來減少缺血損傷［12］;IGF-1在小鼠身上的超表達(dá)能保護(hù)心肌梗死后的心肌細(xì)胞，減少心肌細(xì)胞的死亡，并減弱心室壁的壓力，減緩心室的擴(kuò)張及肥大，并能抵抗非梗塞冠狀動(dòng)脈的收縮對心臟造成的損害［13］。因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，白藜三醇誘導(dǎo)血管發(fā)生與多種血管生長因子表達(dá)增多相關(guān)，有利于側(cè)支循環(huán)的進(jìn)一步形成，其對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用主要與介導(dǎo)IGF-1的高表達(dá)相關(guān)。

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