王麗娜，陳永福，岳小強

(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院中醫(yī)系，上海 200433)

腫瘤的發(fā)生與遺傳、免疫、精神、環(huán)境等多種因素有關，其中環(huán)境因素在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。原發(fā)性肝癌是嚴重危害健康和生命的惡性腫瘤之一，其發(fā)病呈現(xiàn)明顯的地域性，高發(fā)地區(qū)具有高熱、潮濕等特性。本實驗模擬寒熱環(huán)境刺激，觀察其對DEN誘發(fā)性大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料和方法

1.1 動物

Wistar雄性大鼠，清潔級，中科院上海實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學實驗動物中心清潔級動物房。

1.2 主要試劑

二乙基亞硝胺 (diethylnitro samine，DEN)，購自東京化成工業(yè)株式會社;0.9%氯化鈉溶液。大鼠白介素－2(interleukin－2，IL－2)ELISA試劑盒，大鼠白介素－4(interleukin－4，IL－4)試劑盒，大鼠白介素－10(interleukin－10，IL－10)試劑盒，大鼠干擾素－γ(interferon－γ，IFN－γ)ELISA試劑盒，由上海西唐生物科技有限公司進口分裝。

1.3 主要儀器

海爾電冰柜，型號:BC/BD－167SC，購自海爾公司;電熱恒溫鼓風干燥機，型號:DHG－9140A，購自上海恒一科技有限公司。

1.4 動物分組及模型制備

Wistar大鼠42只，隨機分組為4組:肝癌模型 (12只)、熱環(huán)境組 (12只)、寒環(huán)境組 (12只)和空白對照組 (6只)。模型、熱環(huán)境、寒環(huán)境組均按體質(zhì)量10mg/kg給予0.2%DEN灌胃，每日1次，5次/周，至14周末停藥，停藥后自然生長6周，20周后處死動物。模型組在 (22±2)℃環(huán)境下顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，人工照明，光照為12L:12D，相對濕度為50%～80%;熱環(huán)境組置于 (36±2)℃恒溫鼓風干燥機中給予熱刺激3h，1次/日;寒環(huán)境組置于 (0±2)℃冰箱中給予寒刺激3h，1次/日，其余條件同前飼養(yǎng)?？瞻讓φ战M于 (22±2)℃環(huán)境下，其余條件同前飼養(yǎng)，并給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，5次/周，至14周末停止，停藥后，熱環(huán)境、寒環(huán)境組繼續(xù)給予寒熱刺激，20周末處死所有動物。

1.5 肝組織病理學觀察

HE染色鏡檢，按1987年全國實驗腫瘤病理專題座談會紀要所制定的標準進行病理診斷[1]，肝細胞性肝癌采用Edmonson方法進行分級診斷。

1.6 血清IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ檢測

ELISA方法檢測。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS10.0軟件統(tǒng)計系統(tǒng)進行統(tǒng)計處理。計量資料以表示。組間差別采用單因素方差分析，組與組之間比較采用q檢驗，以P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及成瘤率和死亡率的觀察

隨寒熱環(huán)境干預的進行，熱環(huán)境組大鼠逐漸出現(xiàn)煩躁，活動增加，不停抓撓鐵籠，腹部上翻，耳朵、尾巴顏色加深，多汗;寒環(huán)境組大鼠聚集扎堆，身體蜷縮，背毛豎立，耳朵、尾巴顏色變淡;空白對照組和模型組無明顯變化。在造模8周后，除空白對照組外，各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的消瘦、脫毛、爪/毛少光澤等表現(xiàn)，體重下降，熱環(huán)境組體重下降最明顯;各組均有大鼠死亡，模型組死亡2只，熱環(huán)境組死亡4只，寒環(huán)境組死亡2只，均為自然死亡，解剖后見到肝臟紫黑，嚴重腫脹，布滿顆粒;20周末處死大鼠解剖發(fā)現(xiàn)模型和熱環(huán)境組肝臟重度腫脹，彌漫性肝硬變，滿布大小不等的灰白色結(jié)節(jié)和灰褐色顆粒;寒環(huán)境組肝臟腫脹程度稍輕，質(zhì)軟，散在分布數(shù)個灰白色結(jié)節(jié);空白對照組肝臟外觀正常，表面無結(jié)節(jié)。結(jié)果見表1。

2.2 寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性肝癌大鼠脾指數(shù)的影響

模型、熱環(huán)境、寒環(huán)境和N組比較，脾臟顯著增大 (P＜0.05);熱環(huán)境組增大最為明顯、寒環(huán)境組增大幅度較小，并小于模型組，熱環(huán)境、寒環(huán)境兩組差異顯著 (P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體重與死亡率、成瘤率 ()

表1 各組大鼠體重與死亡率、成瘤率 ()

與正常組比較，*P＜0.05;與熱環(huán)境組比較，△P＜0.05。

/%空白對照組組別 n 體重/g 死亡率/% 成瘤率6 431.17±19.79 0 0模型組 12 317.60±46.62* 16.67 83.3*熱環(huán)境組 12 305.75±14.55* 33.33 91.7*寒環(huán)境組 12329.90±35.26＊△ 16.67 66.7＊△

2.3 寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性肝癌大鼠肝臟組織學影響

HE染色顯示，空白對照組肝組織正常表現(xiàn)，經(jīng)DEN染毒后，其余3組大多為肝細胞性肝癌伴周圍組織肝硬化，少數(shù)為肝硬化，寒環(huán)境組1只大鼠僅為肝纖維化。結(jié)果見圖1。

2.4 寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性肝癌大鼠Th1、Th2細胞因子的影響

干預20周后，ELISA檢測血清細胞因子，結(jié)果顯示，模型、熱環(huán)境、寒環(huán)境和N組比較，IL－2、IFN－γ呈顯著下降趨勢，其中熱環(huán)境組最低，而在寒環(huán)境中的寒環(huán)境組相對高;IL－4、IL－10則顯著升高，數(shù)值最高的為熱環(huán)境組，而寒環(huán)境組則相對較低，具體數(shù)值見表2。

表2 各組大鼠的血清Th1、Th2細胞因子的濃度 ()

表2 各組大鼠的血清Th1、Th2細胞因子的濃度 ()

與正常組比較，*P＜0.05;與熱環(huán)境組比較，△P＜0.05。

組別 IL－2/(pg/mL) IFN－γ/(pg/mL) IL－4/(pg/mL) IL－10/(pg/mL)空白對照組 28.08±8.62 21.53±6.42 6.00±0.99 49.68±17.21模型組 15.17±4.19 6.32±2.14＊△ 10.99±4.91 72.36±10.36＊△熱環(huán)境組 8.59±4.29* 3.38±1.32* 15.29±6.96* 90.38±16.18*寒環(huán)境組 15.49±7.16 8.15±3.17＊△ 7.82±5.51 60.31±13.86△

3 討論

研究已證實，腫瘤的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中環(huán)境因素在腫瘤的發(fā)病中起著重要作用，如肝癌的分布具有明顯的地域環(huán)境特征[2]，就世界范圍而言，肝癌高發(fā)的國家和地區(qū)主要分布在亞洲的東南亞和非洲的東南非，在中國主要集中在東南沿海，高發(fā)地區(qū)氣候均具有溫暖、潮濕、多雨的特點[3]。中醫(yī)理論認為，外界環(huán)境不但可以影響人的生理、導致機體發(fā)病，而且對人的疾病過程也會產(chǎn)生各種的影響。祖國醫(yī)學將外界環(huán)境分為“風寒暑濕燥火”六大類，每一類均是導致疾病發(fā)生的重要原因，且在致病和疾病演變上各有特點。根據(jù)陰陽學說，又可以把它們進一步分為陰陽兩大類，其中寒和熱是陰陽兩類外環(huán)境致病因素的典型代表?；谏鲜稣J識，我們以環(huán)境中的寒熱變化 (溫度)為切入點，觀察不同寒熱環(huán)境刺激對DEN誘發(fā)性大鼠肝癌模型腫瘤生物學特征的影響。在預實驗的基礎上，設定了熱環(huán)境溫度36±2℃和寒環(huán)境溫度0±2℃。實驗20周后觀察到，寒熱環(huán)境的兩組與模型組比較，盡管趨勢明顯，但統(tǒng)計差異不顯著;但兩者比較，熱環(huán)境下DEN誘發(fā)性肝癌大鼠的成瘤率和脾指數(shù)明顯要比寒環(huán)境下的高，初步說明長期的寒、熱不同環(huán)境刺激可能會對腫瘤的生成和預后產(chǎn)生不同的影響。

免疫系統(tǒng)是機體對抗外來病原體及有效防止腫瘤形成和生長的重要屏障，主要包括細胞免疫和體液免疫，分別由不同的細胞及其分泌物介導。其中T細胞介導的細胞免疫，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，T淋巴細胞又分為Th1、Th2兩個功能亞群[4]，以表達IL－2和 IFN－γ為主的Th1細胞，可以增強殺傷性效應細胞的細胞毒性作用，主要介導抗腫瘤的細胞免疫反應;以表達IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、IL－13為主的Th2型細胞，促進機體抗體的產(chǎn)生，介導體液免疫反應，同時也抑制Th1細胞分泌其系列因子。近年來研究表明[5]，大多數(shù)腫瘤患者和荷瘤動物體內(nèi)Th1細胞功能下降，而Th2細胞功能相對升高，具體表現(xiàn)在Th1細胞產(chǎn)生的細胞因子減少，而Th2細胞產(chǎn)生的細胞因子增多。Th1型細胞因子較Th2型細胞因子分泌增多稱為Th2/Th1型偏移，Th2型細胞因子較Th1型細胞因子分泌增多稱為Th1/Th2型偏移[6]，Th1/Th2型偏移，提示機體細胞免疫功能下降，免疫監(jiān)視功能降低，有利于腫瘤的生長;Th2/Th1型偏移，則細胞免疫功能增強，具有有效的抑制腫瘤生長的效應[7]。本實驗觀察到，熱環(huán)境下DEN誘發(fā)性的肝癌大鼠IL－2和IFN－γ分泌均減少，而IL－4、IL－10分泌則增多，發(fā)生了Th1/Th2型偏移，與模型組的變化一致;而寒環(huán)境組與正常對照組比較，僅IFN－γ分泌減少，但卻明顯高于熱環(huán)境下肝癌大鼠分泌量。這一結(jié)果提示，熱環(huán)境可能通過抑制T細胞分泌Th1型細胞，增加Th2型細胞，從而進一步加重了DEN誘發(fā)性的肝癌大鼠免疫抑制狀態(tài)，而寒環(huán)境則似對上述病理過程有一定的改善作用，這可能是寒熱環(huán)境對DEN誘發(fā)性大鼠肝癌模型產(chǎn)生不同影響的機制之一。本文只是從肝癌模型大鼠的免疫因子受寒熱刺激影響的角度進行了觀察，對于寒熱環(huán)境刺激對于正常大鼠免疫因子的影響本文未做研究，這可以作為進一步研究的方向之一。

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