王 蕾，舒 旭，伍世揮，吳和平，舒筱燦，羅 海

(懷化醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南懷化 418000)

動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重危害人類健康;機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，自由基增加導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的危險(xiǎn)因素［1］。體內(nèi)有多種酶參與ROS生成，目前NADPH氧化酶被認(rèn)為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體，它是由多個(gè)亞基組成的酶復(fù)合體，主要包括5個(gè)亞組分，其中 gp91phox和p22phox為胞膜組分，p47phox、p67phox及 Rac為胞質(zhì)組分［2］。已發(fā)現(xiàn)的 gp91phox同工酶家族有NOX1、NOX2(gp91phox)、NOX3、NOX4、NOX5 等成員［2-4］，內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá) NOX4和NOX2。

他汀類藥物現(xiàn)已成為降膽固醇的首選藥物。近年研究提示，他汀類藥物除降血脂的作用外，還有其他非降脂作用。為了探討他汀類藥物抗氧化機(jī)制，本研究用辛伐他汀(simvastatin)處理臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，觀察NADPH氧化酶各亞基表達(dá)及ROS生成的變化，為探尋動(dòng)脈粥樣硬化氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)措施提供新線索。

1 材料與方法

1.1主要材料M199培養(yǎng)基、HEPES、明膠和Trizol為Gibco產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為 PROMEGA產(chǎn)品，細(xì)胞內(nèi)ROS檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司，胎牛血清為HYCLONE產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1HUVEC分離培養(yǎng)用Ⅱ型膠原酶消化法分離培養(yǎng)HUVEC，免疫熒光法檢測Ⅷ因子進(jìn)行鑒定。1.2.2細(xì)胞處理不同濃度辛伐他汀分組:①不加辛伐他汀對(duì)照組;②10-10mol·L-1辛伐他汀處理2 h組;③10-9mol·L-1辛伐他汀處理2 h組;④10-8mol·L-1辛伐他汀處理2 h組。辛伐他汀不同處理時(shí)間組:①不加辛伐他汀對(duì)照組;②10-8mol·L-1辛伐他汀處理0.5 h組;③10-8mol·L-1辛伐他汀處理1 h組;④10-8mol·L-1辛伐他汀處理2 h組。

1.2.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶各亞基表達(dá)用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞總RNA;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PROMEGA公司試劑盒的實(shí)驗(yàn)程序完成;PCR引物序列見Tab 1。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳;電泳條帶采用Pharmacia Biotech凝膠成像系統(tǒng)分析。

Tab1 Sequence of primer

1.2.4細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測以DCFH-DA為探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行熒光標(biāo)記，未加DCFH-DA為陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組加陽性藥物(試劑盒提供)5 μl，未加辛伐他汀處理為對(duì)照組，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均用±s表示，用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1HUVECⅧ因子鑒定結(jié)果細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光，而未加一抗(用PBS代替一抗)的陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見熒光，證實(shí)分離得到的細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。

Fig 1 Expression of factorⅧin HUVEC detected by immunofluorescence

2.2NADPH氧化酶各亞基表達(dá)對(duì)辛伐他汀濃度依賴性應(yīng)用不同濃度辛伐他汀(10-10，10-9，10-8mol·L-1)處理 HUVEC 2 h，用 RT-PCR分析NADPH氧化酶各亞基表達(dá)對(duì)辛伐他汀的濃度依賴性。RT-PCR結(jié)果顯示:與不加辛伐他汀的對(duì)照組相比，不同濃度辛伐他汀處理 HUVEC 2 h后，NOX4、p22phox mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05，n=3);10-8mol·L-1辛伐他汀處理2 h后p67phox mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05，n=3)而 10-10，10-9mol·L-1辛伐他汀處理2 h后p67phox mRNA表達(dá)無明顯變化;NOX2、RAC mRNA表達(dá)無變化。

2.3NADPH氧化酶各亞基表達(dá)對(duì)辛伐他汀時(shí)間依賴性為了進(jìn)一步確定NADPH氧化酶各亞基表達(dá)對(duì)辛伐他汀時(shí)間依賴性，我們用10-8mol·L-1辛伐他汀分別處理HUVEC 0.5、1和2 h。RT-PCR結(jié)果顯示:與不加辛伐他汀的對(duì)照組相比，辛伐他汀處理0.5 h后 HUVEC中 p67phox、p22phox mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05，n=3);辛伐他汀處理2 h后HUVEC中NOX4 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05，n=3)而辛伐他汀處理0.5 h、1 h NOX4 mRNA表達(dá)無明顯變化;NOX2、RAC mRNA表達(dá)無變化。

2.4辛伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響為了觀察辛伐他汀在下調(diào)NADPH氧化酶各亞基表達(dá)的同時(shí)是否也降低ROS生成量，我們以DCFH-DA為熒光探針用流式細(xì)胞儀檢測HUVEC內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，與不加辛伐他汀的對(duì)照組(67.6±3.2)相比，10-8mol·L-1辛伐他汀處理2 h后 HUVEC中 ROS(28.1±2.1)降低(P＜0.05，n=3)。

Fig 2 Effects of different concentration of simvastatin on mRNA expression of NADPH oxidase in HUVEC

3 討論

他汀類藥物現(xiàn)已成為降膽固醇的首選藥物，其作用機(jī)制是通過選擇性阻斷HMG-CoA還原酶結(jié)合位點(diǎn)，影響膽固醇的生物合成，加速LDL的降解，從而有效地降低血脂。近年研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了調(diào)脂作用外，還存在其他作用如保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞［6］，抑制心肌肥厚、改善心功能［7］，促進(jìn)斑塊穩(wěn)定，抑制平滑肌細(xì)胞增殖與遷移以及抑制LDL的氧化修飾等。Suh等［3］研究發(fā)現(xiàn)他汀可能通過抑制Rac GTP酶活性及其易位而抑制血管平滑肌細(xì)胞NADPH氧化酶的激活，從而降低由AngⅡ或EGFR誘發(fā)活性氧的生成。Wassmann等［5］在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證明阿托伐他汀能下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞NOX1的表達(dá)且阻斷Rac從胞質(zhì)到胞膜的易位，從而減少ROS的生成;而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中阿托伐他汀能下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞NOX1和p22phox的表達(dá)。本研究表明辛伐他汀處理內(nèi)皮細(xì)胞2 h后 NOX4、p67phox、p22phox mRNA表達(dá)明顯下調(diào)且活性氧生成明顯減少，由此我們推測辛伐他汀可能通過下調(diào)NADPH氧化酶的各亞組分表達(dá)來減少活性氧的生成，從而發(fā)揮抗氧化作用。

Fig 3 Effects of simvastatin for different time on mRNA expression of NADPH oxidase in HUVEC

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