小鼠體溫對(duì)體積描記箱內(nèi)壓力變化的影響

徐衛(wèi)華

(浙江省立同德醫(yī)院呼吸科，浙江 杭州 310012)

小動(dòng)物在一個(gè)密封的體積描記箱內(nèi)呼吸，將引起描記箱內(nèi)壓力變化，從而推導(dǎo)出一些小動(dòng)物的肺功能指標(biāo)。這些壓力變化主要有兩個(gè)來(lái)源:吸氣時(shí)胸廓膨脹引起的氣體壓縮，以及空氣吸入肺內(nèi)由于溫化和濕化作用，后者使吸入氣體進(jìn)一步膨脹從而進(jìn)一步壓縮胸廓外體積描記箱內(nèi)氣體。

在測(cè)量小動(dòng)物肺功能時(shí)，除采用整體體積描記法(whole body plethysmography)外，還使用雙室體積描記法(double-chamber plethysmography)或軀體體積描記法(head-out plethysmography)。鑒于小動(dòng)物呼出的氣體溫度高于描記箱內(nèi)氣體的溫度，可能影響實(shí)際測(cè)量結(jié)果，有學(xué)者在頭室的壁上設(shè)置通口，并以固定的流量(500 ml/min)將頭室內(nèi)空氣交換為新鮮空氣，以去除頭室內(nèi)溫度變化的影響。

由于動(dòng)物體溫高于描記箱內(nèi)的空氣溫度，因此除動(dòng)物肺內(nèi)的溫化和濕化作用外，在描記箱內(nèi)的空氣亦存在加溫過(guò)程。Amdur和Mead觀察了整體體積描記箱內(nèi)動(dòng)物體溫對(duì)箱內(nèi)溫度和壓力變化的影響，但未涉及體積描記箱內(nèi)溫度變化趨勢(shì)以及具體變化數(shù)據(jù)。另外，體積描記箱內(nèi)動(dòng)物呼吸運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的熱量，是否亦對(duì)描記箱內(nèi)溫度和壓力產(chǎn)生影響?更重要的是，在壓力型體積描記箱內(nèi)由動(dòng)物體溫引起的壓力變化是否會(huì)影響小動(dòng)物的呼吸頻率和描記箱內(nèi)壓力變化幅度等問(wèn)題均未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究觀測(cè)了放置有小鼠的整體體積描記箱、雙室體積描記箱以及軀體體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化，并研究這些壓力變化對(duì)小鼠的呼吸頻率和呼吸幅度的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 本研究使用6－8周齡、體重為18～22 g的雌性BALB/c小鼠(浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)的清潔級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的規(guī)定操作。小鼠在實(shí)驗(yàn)前1 h進(jìn)入測(cè)量實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)溫度(19.5 ±0.5)℃、濕度為 50%的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。對(duì)小鼠進(jìn)行的氣管插管操作，先用1%戊巴比妥鈉以5 ml/kg的劑量腹腔注射麻醉，再用2 cm長(zhǎng)的12G自制氣管插管針對(duì)小鼠行氣管插管，外科手術(shù)縫線結(jié)扎固定插管針。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠用超劑量戊巴比妥腹腔注射麻醉處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與配置 本研究所使用體積描記箱同文獻(xiàn)所述:呈正方體型，中空體積為(3×4×12)cm，兩個(gè)體積描記箱可由小三通管連通成一個(gè)雙室體積描記箱，亦可分開(kāi)成整體體積描記箱或者軀體體積描記箱。每個(gè)描記箱均連接一個(gè)壓力傳感器，壓力信號(hào)由壓力傳感器測(cè)量并由Medlab U/4CS系統(tǒng)(南京美易科技貿(mào)易有限公司)處理?；€壓為壓力曲線的基線部分，振幅壓為壓力曲線的振幅部分。

Medlab U/4CS系統(tǒng)工作條件、描記箱內(nèi)壓力和容量的校準(zhǔn)換算均與既往研究相同。溫度測(cè)量使用科學(xué)實(shí)驗(yàn)溫度計(jì)(上海華晨醫(yī)學(xué)器械有限公司)，精度為0.01℃，測(cè)量時(shí)該溫度計(jì)從蓋板中心孔隙進(jìn)入描記箱內(nèi)0.5 cm。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本研究由以下3個(gè)實(shí)驗(yàn)組成。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)1 小鼠體溫對(duì)整體體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化的影響。8只小鼠麻醉后放入整體體積描記箱，記錄小鼠呼吸時(shí)描記箱內(nèi)的壓力變化曲線，每分鐘測(cè)量1次描記箱內(nèi)的溫度和壓力曲線的基線壓。6 min后將小鼠取出，并予超劑量戊巴比妥腹腔注射將小鼠致死。然后，把死亡小鼠放回到另一整體體積描記箱，再次測(cè)量描記箱內(nèi)溫度和壓力變化，每分鐘1次，共測(cè)量6 min。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)2 小鼠體溫對(duì)雙室體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化的影響。8只小鼠按前描述的程序麻醉及氣管插管后，放入雙室體積描記箱的軀體室，插管針連接到描記箱之間的三通管，使其從頭室呼吸。同步測(cè)量?jī)墒覂?nèi)的溫度和壓力變化。溫度和基線壓每2 min測(cè)量1次，共測(cè)量20 min。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)3 體積描記箱內(nèi)溫度變化所致的壓力變化對(duì)小鼠呼吸頻率和壓力變化幅度的影響。兩個(gè)相互獨(dú)立的軀體體積描記箱，將其中一箱體保持對(duì)外密封(密封式軀體體積描記箱)，另一箱體則每2 min內(nèi)對(duì)外開(kāi)放1 min(開(kāi)放式軀體體積描記箱)。本實(shí)驗(yàn)的小鼠均先進(jìn)行麻醉和氣管插管，步驟同上。

8只小鼠依次被放入密封式軀體體積描記箱，氣管插管針與描記箱前壁的三通管連接。這樣小鼠從外界呼吸空氣，而軀體在描記箱內(nèi)。小鼠的呼吸頻率和箱內(nèi)壓力變化幅度每2 min測(cè)量1次，共測(cè)量22 min。

另8只小鼠依次被放入開(kāi)放式軀體體積描記箱，實(shí)驗(yàn)步驟與密封式軀體體積描記箱的小鼠相同。當(dāng)兩個(gè)描記箱都對(duì)外密封時(shí)，同步測(cè)量小鼠的呼吸頻率和描記箱內(nèi)壓力變化幅度，每2 min記錄1次，連續(xù)22 min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，每個(gè)指標(biāo)的數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)1、2中的數(shù)據(jù)，采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上不同組之間的溫度和壓力變化。實(shí)驗(yàn)3采用隨機(jī)區(qū)組方差分析不同時(shí)間點(diǎn)及不同小鼠的呼吸頻率和壓力變化。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整體體積描記箱內(nèi)麻醉小鼠和死亡小鼠引起的溫度及壓力變化 在注入0.2 ml空氣后，體積描記箱內(nèi)壓力迅速上升至1.06 mmHg并保持水平不衰減。圖1A顯示，當(dāng)麻醉小鼠置于體積描記箱，在6 min內(nèi)箱內(nèi)溫度從(19.94±0.06)℃升高至(21.14±0.20)℃，而死亡小鼠溫度從(19.95±0.04)℃升高至(21.12±0.16)℃。二者引起的溫度升高均大約為1.2℃，且在每分鐘的觀察點(diǎn)，兩組溫度之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。圖1B顯示，麻醉小鼠引起的體積描記箱內(nèi)基線壓在6 min內(nèi)從0 mmHg升高至(2.710±0.428)mmHg，而死亡小鼠的基線壓增加為(2.671±0.377)mmHg。在每分鐘的觀察點(diǎn)，二者引起的壓力變化均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 整體體積描記箱內(nèi)麻醉小鼠和死亡小鼠引起的溫度和壓力變化曲線Fig.1 Temperature and pressure changes inside whole body plethysmograph generated from anesthetized mice and dead mice

2.2 雙室體積描記箱內(nèi)溫度和壓力變化 軀體室的溫度在20 min內(nèi)從(19.05±0.26)℃增加至(20.97±0.18)℃，在每個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)上均顯著高于頭室(P＜0.001)，后者從(19.05±0.26)℃升高至(19.14±0.34)℃。其中在14 min的觀察點(diǎn)，軀體室及頭室內(nèi)溫度達(dá)到高峰，分別較起始溫度增加2.01℃和0.41℃。在4 min的觀察點(diǎn)，軀體室的溫度較起始溫度增加1.03℃，為溫度升幅最大時(shí)間點(diǎn)，升幅達(dá)51.32%。軀體室的基線壓，在20 min內(nèi)升高(5.554±0.224)mmHg，在每個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)上均顯著高于頭室(P＜0.001)，后者20 min升高(0.627±0.552)mmHg(圖2B)。

圖2 頭室和軀體室內(nèi)溫度和壓力變化曲線Fig.2 Temperature and pressure changes inside head chamber and body chamber

2.3 密封室及開(kāi)放室內(nèi)小鼠呼吸頻率和壓力變化幅度 小鼠放置于密封室內(nèi)，其呼吸頻率由初始的(125.04±22.39)次/min迅速上升至(168.45±36.37)次/min(圖3A)，隨機(jī)區(qū)組方差分析的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示在不同的時(shí)間觀察點(diǎn)上小鼠的呼吸頻率存在顯著性差異(F=4.751，P＜0.001)。而不同小鼠間隨機(jī)區(qū)組因素的F值為26.238，P＜0.001，提示隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)良好。小鼠呼吸引起的壓力變化幅度呈逐漸下降趨勢(shì)，由最高的(1.090±0.245)mmHg逐漸下降至(0.883±0.168)mmHg(圖3B)。在不同時(shí)間觀察點(diǎn)之間亦存在顯著性差異(F=2.535，P=0.009)。不同小鼠間壓力幅度的隨機(jī)區(qū)組因素的F值為32.770，P＜0.001，提示隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)良好。在開(kāi)放室內(nèi)，小鼠的呼吸頻率在120次/min左右，最低為(115.74±26.19)次/min，最高為(129.30±40.10)次/min(圖3A)，小鼠的呼吸頻率在不同時(shí)間觀察點(diǎn)之間無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.472，P=0.915)。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)顯示不同小鼠間F值為63.389，P＜0.001，提示隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)良好。小鼠呼吸時(shí)壓力變化的振幅在1 mmHg左右，最低為(0.980±0.178)mmHg，最高為(1.032±0.231)mmHg(圖3B)，不同時(shí)間觀察點(diǎn)間比較無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.396，P=0.192)。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)在壓力幅度的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示不同小鼠間F值為370.964，P＜0.001，提示隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)良好。

3 討論

1868 年，Bert首先提出體積描記法概念和操作原理與步驟，并將其用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)。隨后，經(jīng)學(xué)者們進(jìn)一步改進(jìn)，使其更適合于小動(dòng)物呼吸生理的測(cè)試。

當(dāng)用體積描記法測(cè)量小鼠的呼吸生理參數(shù)時(shí)，假設(shè)描記箱內(nèi)的壓力為P，容量為V，吸氣前描記箱內(nèi)溫度為T;假設(shè)呼氣后描記箱內(nèi)壓力為P，V為吸入氣體體積，V為呼出氣體體積，T為一次呼吸后描記箱內(nèi)溫度。這樣，在一次呼吸后，根據(jù)玻義耳定律公式:

當(dāng) T為 20℃，T是 21℃，而 P為 760 mmHg，則P將可以計(jì)算出:

圖3 密封室及開(kāi)放室內(nèi)小鼠呼吸頻率和壓力幅度變化曲線Fig.3 Changes curve of respiratory frequencies and amplitudes of pressure of mice in the sealed head-out plethysmograph and open head-out plethysmograph

從公式4可知，當(dāng)溫度升高1℃，描記箱內(nèi)壓力將升高約2.6 mmHg。

體積描記法按照小動(dòng)物放置的位置不同，可分為整體體積描記法和雙室體積描記法。而按照測(cè)試物理原理的不同，又可分為壓力型體積描記法和流量型體積描記法。由于氣體流量信號(hào)遠(yuǎn)小于壓力信號(hào)，對(duì)傳感器精確度要求高，因此有不少學(xué)者利用壓力型體積描記法進(jìn)行小動(dòng)物呼吸生理相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)用壓力型體積描記法測(cè)量小動(dòng)物呼吸生理參數(shù)時(shí)，在室溫條件下，由于描記箱內(nèi)空氣低于小動(dòng)物體溫，動(dòng)物體表的熱量將輻射至描記箱內(nèi)空氣，因此空氣的溫化過(guò)程在動(dòng)物肺外即體積描記箱內(nèi)也同樣存在。實(shí)驗(yàn)1的結(jié)果顯示，描記箱內(nèi)溫度在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始6 min內(nèi)持續(xù)上升，并使壓力曲線的基線保持同步上升。Lundblad的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用器械撥弄小動(dòng)物的皮毛使熱量加速釋放時(shí)，描記箱內(nèi)壓力加速上升。這說(shuō)明動(dòng)物體溫對(duì)于動(dòng)物所在體積描記箱內(nèi)壓力產(chǎn)生顯著影響，與理論部分的方程式推導(dǎo)結(jié)果一致。麻醉動(dòng)物在體積描記箱內(nèi)，其呼吸運(yùn)動(dòng)本身涉及胸廓及腹部的肌肉運(yùn)動(dòng)，這些運(yùn)動(dòng)將產(chǎn)生熱量。本研究測(cè)量并比較了麻醉小鼠和死亡小鼠對(duì)于整體體積描記箱內(nèi)溫度和壓力的作用，結(jié)果提示二者均使描記箱內(nèi)溫度上升，數(shù)據(jù)十分接近。死亡小鼠去除了肌肉運(yùn)動(dòng)這一影響因素，因此麻醉小鼠所在的體積描記箱內(nèi)溫度變化主要來(lái)源于小鼠的體溫，而并非呼吸運(yùn)動(dòng)本身。

除體溫因素、呼吸所涉及肌肉運(yùn)動(dòng)外，由于小動(dòng)物呼出氣體的溫度亦高于動(dòng)物周圍的空氣，故當(dāng)溫度高的呼出氣體與溫度低的描記箱內(nèi)空氣混合后，將使后者溫度上升，從而導(dǎo)致描記箱內(nèi)壓力上升。實(shí)驗(yàn)2的數(shù)據(jù)顯示頭室內(nèi)溫度及軀體室內(nèi)的溫度均上升，但前者小于后者。有學(xué)者使用設(shè)備將頭室內(nèi)空氣以固定流量向外抽出并泵入同等流量的外界空氣，使頭室內(nèi)空氣的空氣條件保持與實(shí)驗(yàn)前一致。由于軀體室內(nèi)溫度變化遠(yuǎn)高于頭室，因此在使用壓力型雙室體積描記箱測(cè)量小動(dòng)物呼吸生理參數(shù)時(shí)，雙向氣流交換更應(yīng)在軀體室進(jìn)行而非僅局限于頭室。

本實(shí)驗(yàn)3觀察了密封室內(nèi)小鼠的呼吸頻率及呼吸運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的壓力變化幅度，發(fā)現(xiàn)其呼吸頻率在所觀察的22 min內(nèi)逐漸上升，而壓力變化的幅度逐漸下降。同樣的過(guò)程在開(kāi)放室內(nèi)并不存在。開(kāi)放室定期向大氣開(kāi)放，室內(nèi)壓力保持與大氣相近，而不是實(shí)驗(yàn)1和2中保持持續(xù)上升趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示小鼠體溫使箱內(nèi)上升的氣體壓力，能反作用于小鼠的呼吸運(yùn)動(dòng)，使其呼吸頻率增加，潮氣量下降。因此，我們?cè)谟脡毫π腕w積描記法較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)測(cè)量小動(dòng)物肺功能，尤其是頻率和潮氣量等數(shù)據(jù)時(shí)，必需定期開(kāi)放描記箱內(nèi)氣體與外界大氣相通，或者直接使用流量型體積描記法測(cè)量，以避免升高的基線壓影響測(cè)量結(jié)果。

小鼠的體溫顯著影響壓力型整體體積描記箱內(nèi)壓力變化。壓力式雙室體積描記法測(cè)量小鼠呼吸生理參數(shù)時(shí)，頭室及軀體室的溫度和基線壓力均呈上升趨勢(shì)，但前者的變化過(guò)程低于后者。而在壓力型體積描記箱內(nèi)，升高的基線壓力反過(guò)來(lái)作用并影響其中的小鼠的呼吸頻率和潮氣量。

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