陳 姬，陳 娜，陳小宇，張 波，田 卉，鄭秋生

(石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832002)

惡性腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)侵潤(rùn)周圍組織或轉(zhuǎn)移到身體的其他部位，這種侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一個(gè)重要特征，也是腫瘤病人致死和治療失敗的主要原因［1］。小鼠黑色素瘤B16F1細(xì)胞因其來(lái)源及基因背景清楚，已廣泛地用于研究腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程及影響腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的相關(guān)參數(shù)［2］。

紫杉醇(paclitaxel，F(xiàn)ig 2)是目前全世界公認(rèn)治療腫瘤的有效藥物。維泰醇(alternol，F(xiàn)ig 1)是廣東汕頭雙駿生物有限公司利用紅豆杉樹(shù)皮中的一種微生物菌誘變株，經(jīng)發(fā)酵純化等工藝生產(chǎn)出的一種新型化合物。由于維泰醇與紫杉醇具有相同的來(lái)源，因此我們推測(cè)維泰醇有可能同樣具有抗腫瘤的活性。本實(shí)驗(yàn)比較維泰醇與紫杉醇的抗腫瘤轉(zhuǎn)移及抗血管新生作用。探討維泰醇是否也同紫杉醇一樣具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移及抗血管新生的能力。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑維泰醇由廣東汕頭雙駿生物有限公司提供，紫杉醇購(gòu)于Sigma公司。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco BRL公司，新生牛血清，胎牛血清購(gòu)于北京四季青生物工程有限公司。Matrigel購(gòu)于美國(guó)BD公司。MMP-2 ELSAE試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

Fig 1 Chemical structure of alternol

Fig 2 Chemical structure of paclitaxel

1.2SRB法測(cè)定藥物對(duì)B16F1細(xì)胞的抑制率取B16F1細(xì)胞，加入不同濃度的維泰醇和紫杉醇，終濃度為 5、10、20、40、80、160 nmol·L－1，每個(gè)濃度設(shè) 6個(gè)平行空，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各孔OD值。

1.3臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定致死率用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞死亡率。

1.4B16F1劃痕試驗(yàn)按照 Fishman等［3］的試驗(yàn)方法，取細(xì)胞于48孔板，細(xì)胞至0.9融合度時(shí)，以200 μl Tip頭均勻劃痕，用含0.001的小牛血清的培養(yǎng)液輕輕洗去脫落細(xì)胞，各組分別加入不同濃度維泰醇和紫杉醇的無(wú)血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱孵育48 h至空白組劃痕基本愈合。拍照并分析，采用Photoshop 6.0軟件計(jì)算劃痕愈合率。

1.5明膠酶譜實(shí)驗(yàn)明膠酶活性測(cè)定按照Lalu等［4］的方法。收集細(xì)胞上清，明膠酶電泳，結(jié)束后，復(fù)性，孵育。最后以考馬斯亮藍(lán)染色液染色30 min，脫色液脫色至膠條呈藍(lán)色均一背景，亮白色條帶。拍照，并進(jìn)行分析。

1.6MMP-2表達(dá)的測(cè)定MMP-2表達(dá)的測(cè)定使用MMP-2(總)ELISA試劑盒。按照試劑盒操作，酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定OD值。

1.7SRB法測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞活力取ECV304細(xì)胞，加入不同濃度維泰醇與紫杉醇，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行空，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)個(gè)孔OD值。

1.8吖啶橙/溴化乙錠熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)取ECV304細(xì)胞，加入不同濃度維泰醇與紫杉醇，培養(yǎng)48 h，染色，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.9血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕試驗(yàn)取ECV304細(xì)胞，劃痕后加入不同濃度維泰醇與紫杉醇的無(wú)血清培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱孵育48h至空白組劃痕基本愈合。拍照并分析，用Photoshop 6.0軟件計(jì)算劃痕愈合率。1.10管腔樣結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)參照Mezentsev等［5］的方法，將Matrigel膠4℃過(guò)夜溶解，加入到24孔培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)箱促凝30 min，用含0.005胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整ECV304細(xì)胞濃度，接種于Matrigel膠上，37℃ 孵育1 h后，洗滌除去未貼壁的細(xì)胞，每空分別加入含不同濃度維泰醇與紫杉醇的培養(yǎng)基共同孵育20 h。顯微鏡觀察并拍照。

1.11數(shù)據(jù)分析所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較。

2 結(jié)果

2.1B16F1細(xì)胞抑制率比較本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，維泰醇和紫杉醇對(duì)B16F1細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，但維泰醇的增殖抑制作用較弱(Fig 3)。在顯微鏡下觀察，80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇處理后的細(xì)胞貼壁仍比較牢固，培養(yǎng)液中未見(jiàn)大量脫落細(xì)胞，選擇此濃度，在低毒條件下進(jìn)行維泰醇與紫杉醇的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的比較。

Fig 3 Effects of alternol and paclitaxel on B16F1 cell proliferation and survival

2.2B16F1劃痕實(shí)驗(yàn)比較劃痕后培養(yǎng)基中不含血清，細(xì)胞基本不會(huì)增殖，劃痕愈合完全靠細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)，愈合面積代表腫瘤細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力［6］。與空白組相比，80 nmol·L－1維泰醇和紫杉醇均能降低B16F1細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力(Fig 4)，同濃度時(shí)，維泰醇抑制細(xì)胞遷移的能力略弱于紫杉醇。

2.3明膠酶譜實(shí)驗(yàn)MMP-2降解蛋白出現(xiàn)負(fù)染條帶的面積和亮度表現(xiàn)細(xì)胞分泌MMP-2活力的強(qiáng)弱。與空白相比(Fig 5)，80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇處理后的條帶的面積和亮度都有所降低，紫杉醇的條帶明顯弱于維泰醇，說(shuō)明維泰醇抑制B16F1細(xì)胞分泌MMP-2的能力弱于紫杉醇。

2.4MMP-2表達(dá)影響的比較結(jié)果顯示(Fig 6)，與對(duì)照比較，80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇均能降低B16F1細(xì)胞的MMP-2表達(dá)，且維泰醇的作用略弱于紫杉醇。

2.5血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制的比較維泰醇和紫杉醇均能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的增殖(Fig 7)。維泰醇和紫杉醇藥物濃度均為80 nmol·L－1時(shí)，對(duì)ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為0.33和0.57。

Fig 4 Alternol and paclitaxel inhibited the migration of B16F1 cell in vitro

Fig 5 Effects of alternol and paclitaxel on MMP-2 activity of B16F1 cells detected by gelatin zymography assay

Fig 6 Effects of alternol and paclitaxel on MMP-2 expression of B16F1 cells

Fig 7 Effects of alternol and paclitaxel on ECV304 cell proliferation Data are presented as±s from six independent experiments.

2.6誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的比較80 nmol·L－1的維泰醇和紫杉醇作用于ECV304細(xì)胞48 h后即能夠引起明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象(Fig 8)，維泰醇組為早期凋亡，紫杉醇組為晚期凋亡。

Fig 8 Effects of alternol and paclitaxel on ECV304 cell survival

2.7血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的比較劃痕48 h后，空白組細(xì)胞基本愈合(Fig 9)，維泰醇與紫杉醇處理后的細(xì)胞傷痕的愈合程度均降低于空白組，二者均能抑制 ECV304細(xì)胞的遷移，濃度為 80 nmol·L－1，維泰醇抑制ECV304細(xì)胞遷移的能力弱于紫杉醇。

2.8內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)的比較腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移都需要新血管的生成［7－9］。抑制血管生成從而抑制腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)［10］。本實(shí)驗(yàn)(Fig 10)中，空白組細(xì)胞在matrigel膠重建的基底膜上形成完整的血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);80 nmol·L－1的維泰醇處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞拉伸程度降低，彼此間連接縫隙變大，部分血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)生破壞;80 nmol·L－1的紫杉醇處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞連接處已經(jīng)逐漸變圓，血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全被破壞。說(shuō)明二者均能有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，從而對(duì)腫瘤內(nèi)部血管新生產(chǎn)生抑制作用。

3 討論

癌癥治療的目的在于徹底治愈腫瘤或延長(zhǎng)患者生存期或改善患者生活質(zhì)量。當(dāng)前主要治療手段為手術(shù)切除、放療或化療，盡管手術(shù)切除作為早期惡性腫瘤最佳治療選擇，許多腫瘤根治切除后仍會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，一方面局限于目前的診斷手段，不能發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶，另一方面在于手術(shù)切除原發(fā)灶促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移及已有轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)，大多惡性腫瘤患者最終不是死于腫瘤而是死于腫瘤的轉(zhuǎn)移以及轉(zhuǎn)移引發(fā)的并發(fā)癥。因此，開(kāi)發(fā)一類具有預(yù)防惡性腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移作用，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)，適于患者長(zhǎng)期應(yīng)用的惡性腫瘤術(shù)后的輔助治療藥物勢(shì)在必行。

Fig 9 Alternol and paclitaxel inhibited the migration of ECV304 cells in vitro

Fig 10 Tube formation of ECV304 cells inhibited in vitro by alternol and paclitaxel

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞之間相互作用的連續(xù)過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞必須破壞細(xì)胞間質(zhì)和基底膜組成的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)屏障，這是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵一步［11］，在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞會(huì)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，MMPs的表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞株的侵襲能力［12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬蛋白酶的能力呈正相關(guān)。腫瘤的轉(zhuǎn)移，不單單是腫瘤細(xì)胞自身特性發(fā)生變化，還依賴于腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞微環(huán)境之間的相互作用。越來(lái)越多的研究表明［14－15］，血管形成是腫瘤轉(zhuǎn)化，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴新生血管，因此抑制血管新生無(wú)論對(duì)原發(fā)腫瘤，還是腫瘤擴(kuò)散轉(zhuǎn)移都具有重要意義［16］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與紫杉醇相比較，維泰醇具有較低的細(xì)胞毒活性，同時(shí)具有較好抑制腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。這提示維泰醇具有潛在的抗腫瘤活性，具體的機(jī)制需要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。維泰醇致死率和SRB數(shù)據(jù)說(shuō)明其毒性相對(duì)較低，通過(guò)MMP-2和劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可能的作用機(jī)制在于抑制了腫瘤細(xì)胞某些遷移分子的表達(dá)，另一方面，其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成有抑制，說(shuō)明該化合物從兩個(gè)方面來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。雖然維泰醇抗轉(zhuǎn)移能力略弱于紫杉醇，但其低細(xì)胞毒特性依然有望成為新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移化合物。

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