何正光，陳 剛，祝慧鳳，葉 蘭，徐曉玉

(1.重慶師范大學醫(yī)院，重慶 400047;2.重慶工商大學藥物研究中心，重慶 400067;3.西南大學藥學院/重慶市藥效評價工程技術研究中心，重慶 400716;4.貴陽醫(yī)學院藥學院，貴州貴陽 550004)

腦梗死是中老年高發(fā)病，腦梗死后缺血區(qū)微血管受損，缺失［1］。葛根素注射液臨床上廣泛用于腦缺血，療效明顯。對血管內(nèi)皮細胞有促增殖，抑鈣超載，抗氧化等作用［2］，對腦缺血有明顯的保護作用。本實驗用大鼠腦缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，CIR)模型，從促血管新生角度探討葛根素治療腦缺血的機制，觀察其時效、量效關系。

1 材料與方法

1.1動物♂ SD大鼠，體重質(zhì)量(250±30)g，重慶醫(yī)科大學動物中心提供。合格證:SCXK(渝)20020003。

1.2藥品與試劑葛根素注射液，規(guī)格:2 ml:葛根素100 mg，批號20040601，江西銀濤藥業(yè)有限公司。Ⅷ因子抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司;VEGF抗體、Angiopoietin-1抗體、Angiopoietin-2抗體、VEGF原位雜交試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3模型制備、不納入標準及分組按李琴［3］等的方法，線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動脈局灶腦缺血模型，缺血2 h后再灌注。不納入標準:評分低于2分;蛛網(wǎng)膜下腔出血;HE染色無缺血病理改變;未到時相點死亡。每組各6只，隨機分為 12 組:0 h CIR:108、54、27 mg·kg－1;24 h CIR:108、54、27 mg·kg－1;48 h CIR:108、54、27 mg·kg－1。

1.4給藥及取材給予葛根素腹腔注射，每天1次，連續(xù)7 d。模型組給同容積的50%丙二醇。動物達到時相點后，用恒流泵經(jīng)心臟灌注含0.1%DEPC多聚甲醛固定。立刻取腦，作前腦視神經(jīng)交叉處2 mm厚冠狀切片。

1.5檢測

1.5.1神經(jīng)行為學評分動物處死前，參照Zea Longa 5分制標準對神經(jīng)功能評分。

1.5.2免疫組化檢測VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白及MVD，原位雜交檢測VEGF mRNA 用Image proplus 5.0進行光密度(IOD)分析。IOD值均按測得值×10－6計算。MVD的判斷:部位選在海馬近梗死區(qū)半暗帶。

1.6統(tǒng)計學分析軟件SPSS13.0完成數(shù)據(jù)分析，以±s表示，組間用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1葛根素對CIR大鼠行為學改變的影響葛根素組可改善CIR大鼠的神經(jīng)行為障礙，與模型組比，評分減少，差異有顯著性。見Tab1。

Tab 1 Effect of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats with neurological severity score(±s，n=6)

Tab 1 Effect of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats with neurological severity score(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CIR group

Group Dose/mg·kg－1 Neurological severity score 0 h 24 h 48 h Sham 1.83 ±0.26 1.75 ±0.27 1.75 ±0.27 Puerarin 27 1.42 ±0.38* 1.42 ±0.20* 1.33 ±0.26*54 1.25 ±0.27＊＊ 1.33 ±0.26* 1.33 ±0.26*108 1.08 ±0.20＊＊ 1.17 ±0.26＊＊1.25 ±0.27*

2.2葛根素組大鼠VEGF、Ang-1、Ang-2、MVD表達的影響藥物組與模型組比，MVD明顯增加(P＜0.01)。VEGF、Ang-1、Ang-2蛋白表達明顯增加(P＜0.05)。VEGFmRNA原位雜交與VEGF蛋白表達一致。見Tab 2。

3 討論

過度表達［4］或外源性VEGF［5］能使MVD增高。VEGF加重occludin和zonula occluden-1兩種連接蛋白降解致血腦屏障破壞［6］。Ang-1在保持血腦屏障的穩(wěn)定和血管生成中起重要作用［7－8］，聯(lián)用VEGF和Ang-1使血管內(nèi)皮細胞間連接更緊密［9］。聯(lián)用VEGF和Ang-2比單用VEGF更有助血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移［10］。

Tab 2 VEGF，VEGFmRNA，Ang-1，Ang-2 expression of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and the difference of microvessel density(±s，n=6)

Tab 2 VEGF，VEGFmRNA，Ang-1，Ang-2 expression of puerarin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and the difference of microvessel density(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CIR group of same time point

Group(n=6)18 32.67 ±2.88 Puerarin 27 0 3.85 ±0.13＊＊ 3.90 ±0.14＊＊ 3.73 ±0.16＊＊ 4.02 ±0.14* 40.33 ±2.58＊＊54 0 4.12 ±0.23＊＊ 4.16 ±0.19＊＊ 3.90 ±0.08＊＊ 4.06 ±0.21* 49.67 ±2.94＊＊108 0 4.45 ±0.16＊＊ 4.75 ±0.17＊＊ 4.08 ±0.18＊＊ 4.24 ±0.14＊＊ 53.50 ±2.88＊＊Sham 24 3.04 ±0.14 3.08 ±0.13 3.01 ±0.12 3.79 ±0.11 32.83 ±2.71 Puerarin 27 24 3.54 ±0.13＊＊ 3.90 ±0.18＊＊ 3.52 ±0.08＊＊ 4.00 ±0.14* 40.67 ±2.16＊＊54 24 3.86 ±0.12＊＊ 4.09 ±0.14＊＊ 3.75 ±0.11＊＊ 4.01 ±0.16* 50.33 ±2.58＊＊108 24 4.15 ±0.16＊＊ 4.69 ±0.16＊＊ 3.87 ±0.12＊＊ 4.13 ±0.21＊＊ 52.33 ±2.94＊＊Sham 48 3.07 ±0.17 3.09 ±0.13 3.04 ±0.13 3.80 ±0.13 33.17 ±3.77 Puerarin 27 48 3.48 ±0.19＊＊ 3.85 ±0.14＊＊ 3.50 ±0.16＊＊ 3.99 ±0.10* 40.67 ±2.73＊＊54 48 3.77 ±0.18＊＊ 3.93 ±0.22＊＊ 3.72 ±0.15＊＊ 4.01 ±0.13* 49.33 ±2.73＊＊108 48 4.10 ±0.12＊＊ 4.64 ±0.16＊＊ 3.84 ±0.15＊＊ 4.12 ±0.17＊＊ 52.33 ±3.72 MVD Sham 0 3.02 ±0.07 3.07 ±0.10 2.99 ±0.10 3.79 ±0.Dose/mg·kg－1 Time/h VEGF(IOD)VEGF mRNA(IOD)Ang-1(IOD)Ang-2(IOD)＊＊

本研究用大鼠CIR模型，發(fā)現(xiàn)葛根素可明顯改善神經(jīng)行為，增加了MVD及VEGF、Ang-1、Ang-2的表達。大劑量0 h給藥組最為明顯。我們推測葛根素能減輕CIR損傷，機制與促血管生成有關;量效關系有一定的劑量依賴;時效關系顯示，給藥越早，效果越好。

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