韋達(dá)有,伍和明,蔣家霞,付 薇,孫翔翔,何奇松,馬 琳,徐賢坤*

(1.廣西桂林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西桂林 541002;2.廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西南寧 530001)

廣西豬源H9N2亞型流感病毒的分離與鑒定*

韋達(dá)有1,伍和明1,蔣家霞2,付 薇2,孫翔翔2,何奇松2,馬 琳2,徐賢坤2*

(1.廣西桂林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西桂林 541002;2.廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣西南寧 530001)

用SPF雞胚從廣西地區(qū)豬群中分離到1株H9N2型豬流感病毒(SIV),經(jīng)雞胚接種3代后出現(xiàn)穩(wěn)定的雞血紅細(xì)胞凝集效價(jià)為27,且凝集性能被H9亞型陽(yáng)性血清抑制,而不被其他亞型流感病毒陽(yáng)性血清所抑制。分離株的HA基因及NA基因擴(kuò)增結(jié)果顯示,該毒株HA基因與流感病毒H9亞型同源性最高,NA基因與流感病毒N2亞型同源性最高,說(shuō)明該病毒屬于H9N2亞型豬流感病毒,命名為A/Swine/Guangxi/01/2009。

豬流感病毒;H9N2亞型;分離鑒定;HA基因;NA基因

豬流行性感冒(Swine influenza,SI)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病,臨床上以突然發(fā)病、高熱、咳嗽、呼吸困難、反復(fù)發(fā)作、衰竭為特征[1]。目前,SI已遍布美洲、亞洲、非洲、歐洲等世界各地,由于流感病毒可以在豬體內(nèi)發(fā)生基因重排,具有感染人和禽的潛力,因此不僅對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的威脅,而且具有重大公共衛(wèi)生意義[2-4]。

本研究對(duì)廣西地區(qū)疑似感染豬流感病毒的豬群采集鼻咽棉拭子及發(fā)病豬肺組織病料,進(jìn)行病毒分離鑒定。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 滅菌生理鹽水,雙抗(青霉素、鏈霉素各1 000單位/mL),10 ml/L雞紅細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室配制;流感病毒的HA、NA亞型參照抗原和相應(yīng)的抗血清、新城疫病毒(NDV)標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清均由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng);RNA抽提試劑盒購(gòu)自北京天根科技公司,RT-PCR試劑、PMD-18T載體、膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 病料 從廣西桂林市牲畜屠宰場(chǎng)采集的豬肺組織。

1.1.3 SPF雞胚 購(gòu)自北京梅里亞維實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物序列 反轉(zhuǎn)錄引物為通用引物Uni12(參考國(guó)標(biāo))。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的序列,通過(guò)Oligo軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)用于克隆HA和NA基因序列的特異性引物,所有引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增HA和NA基因所用引物Table 1 The primers used for amplified HA and NA genes

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 將研磨好的豬病料3 000 r/min離心3 min取上清液,經(jīng)雙抗處理后接種9日齡～11日齡SPF雞胚(0.2 mL/枚),收取24 h～96 h內(nèi)培養(yǎng)的雞胚,4℃過(guò)夜收集病毒尿囊液,稀釋后經(jīng)SPF雞胚連續(xù)傳3代,測(cè)定HA效價(jià)。

1.2.2 血凝與血凝抑制(HA-HI)試驗(yàn) 用微量血凝板法檢測(cè)收集的尿囊液血凝活性,用H1至H16亞型和ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清、生理鹽水等進(jìn)行常規(guī)血凝抑制試驗(yàn),測(cè)定HI效價(jià),鑒定此病毒。

1.2.3 神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)試驗(yàn) 用9種NA(N1～N9)亞型流感病毒參照抗原及相應(yīng)的抗血清,參考WHO提供的方法,進(jìn)行交叉NI反應(yīng),鑒定病毒的NA亞型。

1.2.4 HA和NA基因的RT-PCR擴(kuò)增 取200 μ L含病毒的雞胚尿囊液用RNA抽提試劑盒提取病毒RNA,然后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

RT 體系(25 μ L):RNA 模 板 15 μ L,5 ×MMLV RTase Reaction buffer5 μ L,dNTPs(10 mmol/L)2 μ L,Uni12 引物(25 pmol/L)2 μ L,Rnasin inhibitor(40 U/(L)0.5 μ L,M-MLV RTase(200 U/(L)0.5 μ L。反應(yīng)條件為42℃1 h;95℃,5 min,反應(yīng)結(jié)束獲得cDNA。

PCR 體系 (25 μ L):cDNA 5 μ L,10 ×ExTaqBuffer 2.5 μ L,MgCl2(2.5 mmol/L)2 μ L,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μ L,上、下游引物(25 pmol/L)各0.5 μ L,ExTaq酶 (5 U/(L)0.3 μ L,ddH2O 12.2 μ L。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 5 min;95℃變性50 s,56℃退火50 s,72℃延伸60 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.5 HA基因和NA基因的克隆與序列分析將PCR產(chǎn)物按照寶生物工程(大連)有限公司提供的PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行目的帶回收。純化回收產(chǎn)物與pMD18-T連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng),經(jīng)涂布于 LB平板上,37℃培養(yǎng)16 h;挑取白色菌落接種到含有 Amp+(100 μ g/mL)5 mL的 LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)16 h;抽提重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切及PCR鑒定。篩選出陽(yáng)性質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的基因序列利用DNA Star軟件進(jìn)行核苷酸同源性分析,并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血清亞型鑒定

2.1.1 HA-HI試驗(yàn) 接種后收集雞胚尿囊液對(duì)10 mL/L雞紅細(xì)胞的凝集反應(yīng),結(jié)果 HA效價(jià)為27。HI試驗(yàn)結(jié)果表明,分離毒株與H9亞型流感病毒陽(yáng)性血清血凝抑制效價(jià)為27,而與其他流感病毒血清亞型和NDV陽(yáng)性血清和陰性血清均沒(méi)有抑制反應(yīng)。

2.1.2 NI試驗(yàn) 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)結(jié)果表明,參照抗原均被相應(yīng)的陽(yáng)性血清抑制,分離毒株NI交叉試驗(yàn)中只被N2亞型陽(yáng)性血清抑制,而其余8個(gè)亞型陽(yáng)性血清均為陰性,表明此株病毒為N2亞型流感病毒。

2.2 HA基因和NA基因擴(kuò)增

HA、NA兩個(gè)基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳獲得大小分別為 615 bp和529 bp的片段(圖 1),擴(kuò)增片段大小與預(yù)期長(zhǎng)度一致。

圖1 HA基因和NA基因RT-PCR產(chǎn)物Fig.1 T he RT-PCR products of HA and NA genes

2.3 HA和NA基因序列分析

將分離到的豬流感毒株(命名為A/Swine/Guangxi/01/09)的HA和NA基因序列(表2)分別與從GenBank下載H1至H16的HA基因序列、N1至N9的NA基因序列進(jìn)行比較,并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2.3.1 HA基因序列分析

2.3.1.1 同源性分析 擴(kuò)增得到的分離株的HA基因與流感病毒H9亞型核苷酸同源性最高,達(dá)到82.9%～96.4%,其中與H9N2亞型豬源、禽源、人源流感病毒參考株同源性分別為96.4%、93.7%、88.4%。而與其他亞型的同源性均在60%以下(圖 2)。

2.3.1.2 遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 分離株的HA基因序列與山東豬流感病毒、北京禽流感病毒、香港人流感病毒的H9N2亞型毒株在最近的分支上,同時(shí)與H9N4和H9N6分支也較近,而與其他亞型的HA基因序列遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

表2 流感病毒HA和NA基因參考序列Table 2 T he reference HA and NA genes of influenza virus in this analysis

圖2 廣西分離株與參考毒株HA基因的核苷酸同源性比較Fig.2 The homology of nucleotide sequence about HA gene among influenza viruses

圖3 HA基因核苷酸遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree analysis for nucleotide of HA gene

2.3.2 NA基因序列分析

2.3.2.1 同源性分析 分離株的NA基因與流感病毒N2亞型核苷酸同源性最高,達(dá)到94%～83.5%,其中與H9N2亞型豬源、禽源、人源流感病毒參考株同源性分別為93.5%、94%、89.3%。而與其他亞型的同源性均在80%以下。

2.3.2.2 遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 分離株的NA基因序列與山東豬流感病毒、北京禽流感病毒、香港人流感病毒 H9N2亞型毒株在最近的分支上,同時(shí)與H2N2和H5N2分支也較近,而與其他亞型的 NA基因序列遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

圖4 NA基因核苷酸遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phy logenetic tree analysis for nucleotide of NA gene

3 討論

豬流感自1918年美國(guó)首次報(bào)道,至今在豬群中已流行近百年。我國(guó)豬流感于1969年臺(tái)灣首次報(bào)道,主要是由H1N1和H3N2亞型流感病毒引起;H9N2亞型流感病毒最初只在禽類以低致病性感染蔓延,1998年從香港豬中首次分離到,隨后1999年中國(guó)大陸和香港先后從疑似流感人群中分離到H9N2亞型流感病毒,序列分析發(fā)現(xiàn)其所有基因片段與早期H9N2亞型禽流感病毒高度同源[5-7]。近幾年,豬源H9N2亞型流感病毒在中國(guó)大陸也時(shí)有報(bào)道,而且引起了一定的發(fā)病率和死亡率,說(shuō)明該亞型毒株已突破禽種間屏障進(jìn)入豬群并在豬群中生息演化[8]。

目前,在豬群中流感病毒主要以H1N1、H3N2和H1N2亞型為主;豬作為流感病毒的易感動(dòng)物,同時(shí)也是流感病毒“禽-豬-人”傳播鏈中的重要中間宿主和“混合器”,流感病毒能在豬體內(nèi)發(fā)生變異和基因重排。在我國(guó)華南地區(qū),環(huán)境和生活方式的原因,給水禽、家禽、豬、人之間提供了更多接觸的機(jī)會(huì),引起流感病毒的跨種間傳播和遺傳變異;基因重排H9N2亞型流感病毒從禽到豬的跨種間傳播目前已經(jīng)被證實(shí),而且有趨勢(shì)通過(guò)基因重排產(chǎn)生適應(yīng)哺乳動(dòng)物的新流感毒株,從而導(dǎo)致人類流感的大流行,如同豬流感病毒 H1N1、H1N2和H3N2[9-10]。因此,H9N2亞型豬流感對(duì)人類健康有潛在的威脅,具有重大的公共衛(wèi)生意義。

本研究通過(guò)HA-HI試驗(yàn)及HA和NA基因序列的分析表明,從廣西豬體分離出的流感病毒屬于H9N2亞型,核苷酸同源性和遺傳進(jìn)化分析,其HA基因與豬源H9N2亞型流感病毒參考株同源性最高達(dá)到了96.4%,而NA基因則與禽源H9N2亞型流感病毒參考株同源性最高達(dá)94%,可知此株流感病毒是禽流感病毒在豬體上得到了適應(yīng)。這為廣西區(qū)豬流感疫情動(dòng)態(tài)和防控及人流感預(yù)防監(jiān)測(cè)提供了重要依據(jù)。

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Isolation and Identification of a Subtype H9N2 Influenza Virus From Swine

WEI Da-you1,WU He-ming1,JIANG Jia-xia2,FU Wei2,SUN Xiang-xiang2,HE Qi-song2,MA Lin2,XU Xian-kun2

(1.Guilin Center f or Animal Disease Prevention and Control,Guilin,Guangxi,541002,China;2.Guangxi Center f or Animal Disease Prevention and Control,Nanning,Guangxi,530001,China)

A H9N2 subtype strain of swine influenza virus(SIV)was isolated from swine in Guangxi by SPF chicken embryo.The SIV strain had a stable haemagglutiain(HA)values for 27after there generations,and can be inhibited by H9 positive serum.The HA and NA genetic amplification showed that this strain had the height homology with the subtype H9N2 SIV,which named A/Swine/Guangxi/01/2009.

SIV;H9N2 subtype;isolation and identification;HA gene;NA gene

S852、659.6;S858.28

B

1007-5038(2011)07-0113-05

2011-01-24

廣西自然科學(xué)基金(2010GXNSFD013033)

韋達(dá)有(1965-),男,廣西桂林人,獸醫(yī)師,主要從事動(dòng)物疫病防控工作。*通訊作者