毋狀元,孫美玉,海里且木,鄭新寶,董 紅,霍 飛,陳靜波*

(1.石河子大學動物科技學院,新疆石河子 832003;2.新疆畜牧科學院畜牧研究所,新疆烏魯木齊 830000)

基因表達差異對牛胚胎發(fā)育潛能的影響*

毋狀元1,孫美玉2,海里且木2,鄭新寶2,董 紅2,霍 飛2,陳靜波2*

(1.石河子大學動物科技學院,新疆石河子 832003;2.新疆畜牧科學院畜牧研究所,新疆烏魯木齊 830000)

隨著牛胚胎體外生產(IVP)技術的不斷成熟,體外胚胎生產在一些國家已進入商業(yè)化運營階段。但與體內胚胎相比其移植受體妊娠率、產犢率及胎兒的后天發(fā)育能力均較差。因此,開發(fā)一種既可靠又實用的檢測胚胎發(fā)育潛能的技術顯得尤為重要。應用實時熒光定量PCR技術檢測早期胚胎基因表達,通過分析mRNA的表達豐度來評價卵母細胞成熟情況和胚胎質量是一種可行的方法。論文綜述了國內外有關牛卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中部分基因mRNA表達狀況,分析了基因表達與胚胎潛能的關系。

基因表達;實時熒光定量PCR;胚胎發(fā)育潛能;牛

在牛胚胎體外生產及胚胎移植工作中,盡管胚胎移植受體妊娠率、胎兒出生率及胎兒的健康狀況是胚胎質量評價的重要標準,但對這3項指標進行評價極其困難。開發(fā)一種即可靠又實用的檢測胚胎發(fā)育潛能的技術就顯得尤為重要,即準確地評估體外生產胚胎的發(fā)育能力是確保體外胚胎移植妊娠率和產犢率的關鍵。一般而言,胚胎形態(tài)學標準通常被作為評估胚胎質量和發(fā)育潛能的標準。形態(tài)學評價標準包括卵丘卵母細胞復合體分級評價(cumulus-oocyte complex,COCs)、原核期評分、早期胚胎評分、囊胚期胚胎評分和胚胎代謝評定。在這一評價體系中,認為具有致密、多層顆粒細胞和均一胞質的COCs是質量較高的卵母細胞;具有 2個原核(pronucleus,PN)、2個極體、規(guī)則的形態(tài)、完整的透明帶,胞質邊緣有清楚的胞質暈是正常受精的表現(xiàn);早期胚胎中碎片較少且較集中,卵裂球大小均一透明;囊胚的孵化程度較高,內細胞團細胞數(shù)目多包裹緊密,滋養(yǎng)層細胞排列緊密被視為具有較強發(fā)育潛能的胚胎;具有最高營養(yǎng)消耗率/銨產量的胚泡植入可能性最大[1]。此外,羅學明等[2]研究認為初次卵裂時間是豬克隆胚胎發(fā)育潛能的重要標識;唐志霞等[3]研究表明異常線粒體數(shù)量的增加、線粒體的異常分布及卵裂球之間線粒體的不均勻分布導致補救單精子注射(intrcytoplsmic sperminjection ICSI)后胚胎發(fā)育潛能低下;黃曉潔等[4]研究顯示,與程序冷凍相比玻璃化冷凍更好的保存了胚胎的發(fā)育潛能;蒲艷等[5]應用偏振光顯微鏡分析了人卵透明帶與胚胎發(fā)育潛能的關系發(fā)現(xiàn),優(yōu)質胚胎組卵子全層透明帶厚度顯著低于劣質胚胎;妊娠組卵子內層透明帶和全層透明帶均低于未妊娠組 。

但生產實踐中相似形態(tài)學特征的體內和體外胚在移植妊娠率、出生率及胎兒發(fā)育能力上均存在較大差異[6]。甚至有些從形態(tài)學上看具有較好發(fā)育潛力的胚胎反而在移植后發(fā)育上不如形態(tài)較差的胚胎,如蘇建民[7]研究發(fā)現(xiàn)有時具有較好致密化和囊胚擴張性的克隆胚胎,在移植后維持妊娠的能力上還不如形態(tài)學標準較差的胚胎。因此,僅依靠形態(tài)學標準評估胚胎質量遠遠不能滿足胚胎發(fā)育潛能評估的要求。

附植前胚胎發(fā)育包括第一次卵裂,胚胎基因組激活、致密化、桑葚胚和囊胚。此過程需要母源基因和合子(胚胎)基因很好的協(xié)調表達。合子基因組激活之前,卵母細胞成熟過程中積累的母源mRNA和已合成的蛋白質共同指導了胚胎的早期發(fā)育。而此時恰是胚胎發(fā)育最敏感的時期,Rivera R M等[8]研究提示各種體外操作即使是最簡單的胚胎移植都會對胚胎印記基因的甲基化及基因表達產生一定程度的影響。牛胚胎基因表達譜分析研究發(fā)現(xiàn),人工受精獲得的胚胎和體外生產的胚胎在基因表達豐度上存在很大差異[9]。王增艷[10]研究結果提示小鼠胚胎的玻璃化冷凍復蘇過程會加重體外授精等操作引起的植入后胎鼠基因組DNA中H19/Igf2 DMD的甲基化丟失,而對H 19/Igf2 DMD基因表達量影響不大,但會加重體外授精等操作引起的H19基因表達減少。胚胎體外操作過程干擾了基因的重編程,最終影響胚胎的發(fā)育潛能。因此,通過分子生物學的方法篩選出那些較易受干擾的基因,通過檢測其表達量的變化來判斷胚胎發(fā)育潛能是胚胎工程研究的熱點之一。

1 卵子和胚胎中mRNA表達分析

要弄清卵母細胞成熟和胚胎早期發(fā)育的分子機制,首先要鑒定差異表達基因。RT-PCR技術使得我們可以研究在單個卵子和單個胚胎中個別基因的表達情況。采用數(shù)據的標準需根據加入的細胞數(shù)量、不同RNA含量及酶活性來矯正RT-PCR參數(shù)。通常用一個管家基因作為內參。內參基因必須保證在不同條件下和不同擴增體系中穩(wěn)定表達。早期胚胎發(fā)育過程中基因的表達是處在變化之中(包括管家基因)。因此,當管家基因表達不穩(wěn)定時,目的基因再與其進行標準化對比時就有可能引起很大偏差。所以,內源性的管家基因和外源性mRNA應該共同被作為參照。

2 基因表達差異對卵母細胞發(fā)育潛能的影響

通常從屠宰動物卵巢上收集的直徑為2 mm～8 mm卵泡的COCs用于體外胚胎生產。這些卵泡一般需要經過數(shù)天后才能發(fā)育到排卵前的大小,所以此時的卵泡因為尚未能產生足夠的激素和生長因子而使卵母細胞沒有積累足夠的母源mRNA,進而不能在體外完成發(fā)育。卵母細胞自身的發(fā)育受一系列基因表達的控制,這些基因使卵母細胞和細胞質成熟。卵母細胞的發(fā)育潛能是卵母細胞質成熟的反映,而且核成熟的卵母細胞因其胞質成熟程度不同而形成的胚胎發(fā)育能力也不同。卵母細胞的發(fā)育能力也決定了卵母細胞的受精、卵裂和隨后的胚胎發(fā)育情況。另外,卵母細胞的發(fā)育潛能是在在卵泡的發(fā)育過程中形成的,腔前卵泡的卵母細胞不能完成第一次減數(shù)分裂,而來自有腔卵泡的卵母細胞能夠完成第一次減數(shù)分裂,來自更大腔前卵泡的卵母細胞發(fā)育能力更強。

卵母細胞在生長期進行轉錄和mRNA的儲存。牛的卵泡生長到大約3 mm時逐步成熟,此時累積在卵子中的轉錄產物,母源mRNA和蛋白質指導卵母細胞成熟、受精、早期卵裂、直至胚胎基因組的激活。mRNA的儲存發(fā)生于卵子的成長過程中,轉錄過程中形成的3′poly(A)末端是一個重要的調節(jié)元件,此元件保證mRNA的穩(wěn)定性。有研究表明轉錄產物大多數(shù)表現(xiàn)出延遲脫腺苷化作用,有一個短的3′poly(A)末端的轉錄產物的卵母細胞往往發(fā)育能力較低,這一事實暗示脫腺苷化作用和腺苷化作用在牛卵母細胞體外成熟中起重要作用[11]。

許多研究工作已經從分子水平探索了牛卵母細胞的發(fā)育能力。這些研究工作分析了體外成熟卵母細胞[12-13]和囊胚[14]的轉錄豐度,研究表明無論培養(yǎng)液中是否添加FSH和顆粒細胞,目的基因的相對豐度沒有變化。然而,添加血清的培養(yǎng)液幾乎降低了所有目的基因的表達量[15]。通常,不同直徑大小卵泡中的卵母細胞基因表達有差異,這一現(xiàn)象暗示卵母細胞成熟狀態(tài)和卵母細胞起始培養(yǎng)的時間與其最終的發(fā)育能力關系密切[16]。牛每個情期有2個～3個卵泡波,在這期間,有卵泡的生長、停滯、優(yōu)勢化和閉鎖。在每一輪卵泡波中有一批卵泡開始生長直至3 min～4 mm。研究表明從生長期和停滯期之間的卵泡中獲得的卵母細胞比從停滯期和優(yōu)勢期卵泡中獲得的卵母細胞有更好的發(fā)育潛能,其囊胚中CX43基因的表達量也高于后者[17]。

從幼年母畜獲得的卵母細胞成功發(fā)育到囊胚的比率遠小于從成年母畜獲得的卵母細胞,這可歸因于葡萄糖轉運蛋白的表達缺陷和蛋白質翻譯的不足且這種缺陷可通過在卵巢內補充IGF-1的到部分的解決[18]。研究表明,持續(xù)性卵泡可導致與胚胎發(fā)育密切相關基因在胚胎發(fā)育過程中表達豐度的改變,并且可能危害到牛早期胚胎的發(fā)育[19]。因此分析卵母細胞成熟過程中基因的mRNA的表達有助于找出牛卵母細胞發(fā)育能力的控制基因。

3 胚胎發(fā)育潛能相關基因

有很多學者對牛早期胚胎發(fā)育過程中mRNA表達模式進行了研究。在桑葚胚和囊胚期用 IVP和其他的技術如體細胞核移植(somatic cell nuclear transfer,scNT),已確定與發(fā)育密切相關基因轉錄的影響。體外環(huán)境和核移植程序對移植前牛胚胎期mRNA的表達有很大影響[6]。在過去10年～15年體外培養(yǎng)系統(tǒng)有了很大改進,如今,絕大多數(shù)的培養(yǎng)系統(tǒng)是已知成分和半已知成分的。然而這些培養(yǎng)系統(tǒng)還是不能完全模擬體內環(huán)境。近期已發(fā)表了很多的在體內外scNT生產胚胎差異表達基因(表3)。通過與體外生產相比較,在羊的輸卵管中培養(yǎng)可獲得更高質量的的囊胚。這樣生產的胚胎候選基因與完全體內生產的胚胎有相似的基因表達水平[27]。

表1 不同來源、不同生理指標和不同培養(yǎng)條件對牛囊胚mRNA表達豐度的影響Table 1 Effects of the different origin,different physidogic index and different culture condition on messenger RNA abundance in bovine blastocysts

4 小結

mRNA表達檢測和其他定量參數(shù)得的結合將有可能對可用胚胎的選擇提供指標。需要在模式動物和試驗動物體上做分子檢測,這對于進一步研究胚胎和胎兒基因的表達模式是一個很好的方向。了解胚胎發(fā)育分子機制對于改善生物技術應用將有很大幫助。

[1]周 云,劉雨生.人類早期胚胎發(fā)育潛能的預測方法學進展[J].國際生殖健康:計劃生育雜志,2008(3):161-164.

[2]羅學明,肖 煒,馮 沖,等.初次卵裂時間是豬克隆胚胎發(fā)育潛能的重要標識[J].生物化學與生物物理進展,2010(12):23-25.

[3]唐志霞,章志國,陳先俠,等.受精失敗的卵母細胞補救單精子卵胞漿內注射后胚胎發(fā)育潛能低下原因[J].中國實用婦科與產科雜志,2010(11):45-50.

[4]黃曉潔,張榮榮,張 雪,等.玻璃化冷凍對卵裂期胚胎發(fā)育潛能的影響[J].中國誤診學雜志,2010,20:67-69.

[5]蒲 艷,黃國寧,王亞平,等.偏振光顯微鏡分析人卵透明帶與胚胎發(fā)育潛能的關系[J].生殖與避孕,2008(6):12-14.

[6]Wrenzycki C,Herrmann D,Lucas-Hahn A,et al.Messenger RNA expression patterns in bovine embry os derived fromin vitroprocedures and their implications for development[J].Reprod Fertil Dev,2005,17:23-35.

[7]蘇建民.不同培養(yǎng)基對牛轉基因克隆胚發(fā)育及印跡基因Igf2甲基化狀況的影響[D].陜西楊陵:西北農林科技大學,2009.

[8]Rivera R M,Stein P,Weaver J R,et al.Manipulations of mouse embryos prior to implantation result in aberrant ex pression of imprinted genes on day 9.5 of development[J].Hum M ol Genet,2008,17:1-14.

[9]Smith S L,Everts R E,Sung L Y,et al.Gene expression profiling of single bovine embryos uncovers significant effects ofin vitromaturation,fertilization and culture[J].Mol Reprod Dev,2009,76(1):38-47.

[10]王增艷.玻璃化冷凍小鼠胚胎對印記基因H19/Igf2印記控制區(qū)甲基化狀態(tài)及基因表達量的影響[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學院,2010.

[11]Lin R.Maternal mRNA and the polyA tail[J].Nature Education,2010,3(9):47.

[12]Racedo S,Herrmann D,Wrenzycki C,et al.Effects of follicle size and stage of maturation on mRNA expression in bovinein vitromatured oocy tes[J].Reprod Fertil Dev,2007,19:291.

[13]Humblot P,Hohn P,Lonergan P,et al.Effect of stage of follicular growth during superovulation on developmental competence of bovine oocytes[J].T heriogenology,2005,63:1149-1166.

[14]Patel O V,Bettegowda A,Ireland J J,et al.Functional genomics studies of oocy te competence:evidence that reduced transcript abundance for follistatin is associated with poor developmental competence of bovine oocytes[J].Reproduction,2007,133:95-106.

[15]Calder M D,Caveney A N,Sirard M A,er al.Effect of serum and cumulus cell expansion on marker gene transcripts in bovine cumulus-oocyte complexes during maturationin vitro[J].Fertil Steril,2005,83:1077-1085.

[16]M ourot M,Dufort I,Gravel C,et al.The influence of follicle size,FSH-enriched maturation medium,and early cleavage on bovine oocyte maternal mRNA levels[J].Mol Reprod Dev,2006,73:1367-1379.

[17]Oropeza A,Wrenzycki C,Herrmann D,et al.Improvement of the developmental capacity of oocytes from prepubertal cattle by intraovarian insulin-like growth factor-I application[J].Biol Reprod,2004,70:1634-1643.

[18]Lingenfelter B M,Dailey R A,Inskeep E K,et al.Changes of maternal transcripts in oocy tes from persistent follicles in cattle[J].Mol Reprod Dev,2007,74:265-272.

[19]Warzych E,Wrenzycki C,Peippo J,et al.M aturation medium supplements affect transcript level of apoptosis and cell survival related genes in bovine blastocysts producedin vitro[J].Mol Reprod Dev,2007,74:280-289.

[20]Smith C,Berg D,Beaumont S,et al.Simultaneous gene quantitation of multiple genes in individual bovine nuclear transfer blastocy sts[J].Reproduction,2007,133:231-242.

[21]Park S Y,Kim E Y,Cui X S,et al.Increase in DNA fragmentation and apoptosis-related gene ex pression in frozen-thawed bovine blastocysts[J].Zygote,2006,14:125-131.

[22]El-Sayed A,Hoelker M,Rings F,et al.Large-scale transcriptional analy sis of bovine embryo biopsies in relation to pregnancy success after transfer to recipients[J].Physiol Genomics,2006,28:84-96.

[23]Beyhan Z,Forsberg E J,Eilertsen K J,et al.Gene expression in bovine nuclear transfer embry os in relation to donor cell efficiency in producing live offspring[J].Mol Reprod Dev,2007,74:18-27.

[24]Smith S L,Evens R E,Tian X C,et al.Global gene ex pression profiles reveal significant nuclear reprogramming by the blastocy st stage after cloning[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102:17582-17587.

[25]M undim T C D,Ramos A F,Sartori R,et al.Changes in gene expression proiles of bovine embryos producedin vitro,by natural ovulation,or hormonal superstimulation[J].Gen M ol Res,2009,8(4):1398-1407.

[26]Knijn H M,Wrenzycki C,Hendriksen P J M,et al.In vitroandin vivoculture effects on mRNA expression of genes involved in metabolism and apoptosis in bovine embryos[J].Reprod Fertil Dev,2005,17:775-784.

[27]M orton K M,Herrmann D,Sieg B,et al.Altered mRNA expression patterns in bovine blastocy sts after fertilisationin vitrousing flow-cytometrically sex-sorted sperm[J].Mol Reprod Dev,2007,74:931-940.

[28]Corcoran D,Rizos D,Fair T,et al.Temporal ex pression of transcripts related to embryo quality in bovine embryos cultured from the two-cell to blastocyst stagein vitroorin vivo[J].M ol Reprod Dev,2007,74:972-977.

Effect of Gene Expression on Developmental Potential of Bovine Embryos

WU Zhuang-yuan1,SUN Mei-yu2,HAI LI Qie-mu2,ZHENG Xin-bao2,DONG Hong2,HUO Fei2,CHEN Jing-bo2

(1.College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinj iang,832003,China;2.Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

With the development of production of bovine embryos(IVP)technology,thein vitroproducted embryo has reached commercial operation stage in some countries.However,compared within vivoproducted embryo,the pregnancy rate of its transplant recipients,calving rate and fetal development capabilities acquired are poorer.Therefore,it is essential to develop reliable and practical test systems for the quality evaluation of embryos.Real-time fluorescence quantitative PCR applying to the expression of early embryonic gene and then analyzing the expression of abundance of mRNA to evaluate oocyte maturation and the quality of embryo have been proven to be a feasible method.This paper reviewed expressions of both maturation of bovine oocytes and that of partial genes of mRNA in early embryonic development and discussed the relationship between the expression of gene and the potential of embryo.

gene expression;real-time fluorescence quantitative PCR;developmental potential of embryo;bovine

S814.8;Q786

A

1007-5038(2011)07-0085-04

2011-01-26

國家自然科學基金項目(30760167)

毋狀元(1984-),男,陜西韓城人,碩士研究生,主要從事動物繁殖學研究。*通訊作者