洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及抗氧化研究

陳 佳，徐懷德,*，米林峰，包 蓉

洋蔥皮總黃酮纖維素酶法提取及抗氧化研究

陳 佳1，徐懷德1,*，米林峰2，包 蓉1

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 榆林市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西 榆林 719000)

采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究纖維素酶法輔助提取洋蔥皮中總黃酮的工藝條件，并對洋蔥皮總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明：洋蔥皮總黃酮最佳提取工藝為纖維素酶用量0.52%、pH5.0、提取溫度48℃、提取時(shí)間105min、料水比(g/mL)1:40，在此條件下，提取率為2.32%。洋蔥皮總黃酮清除DPPH自由基和羥自由基的IC50分別為3.751、4.267μg/mL；同時(shí)洋蔥皮黃酮還原能力較強(qiáng)，高于茶多酚。洋蔥皮總黃酮抗氧化性強(qiáng)，是一種天然有效的抗氧化劑。

洋蔥皮；總黃酮；纖維素酶；提??；抗氧化活性

洋蔥(Allium cepa L.)為百合科蔥屬植物，世界洋蔥產(chǎn)量約4.4億噸，僅次于西紅柿，約占世界蔬菜總量的10%[1]。洋蔥皮中除含有豐富的蛋白質(zhì)、色素、多糖外，還含有4.4%黃酮類物質(zhì)[2]。洋蔥食用和加工過程中產(chǎn)生2%～3%洋蔥皮，數(shù)量相當(dāng)可觀，如不加以利用，將造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染。

黃酮類化合物具有抗氧化、治療心腦血管疾病、抗癌、抗炎等作用[3-6]。洋蔥最外層表皮中槲皮素含量最高，同時(shí)黎乃維等[7]研究表明同一品種洋蔥中的黃酮含量從外鱗葉到內(nèi)鱗葉依次降低。洋蔥總黃酮提取、黃酮含量測定及性質(zhì)的初步鑒別已有文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，但酶法提取洋蔥皮中總黃酮的研究未見報(bào)道。與傳統(tǒng)提取方法相比，酶法提取具有無毒性、效率高、條件溫和等優(yōu)勢[12]，本研究通過纖維素酶法輔助提取洋蔥皮總黃酮，探討洋蔥皮總黃酮的抗氧化性，為洋蔥皮總黃酮開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃皮洋蔥(山東海洋食品營養(yǎng)研究所)，取其外表皮，洗凈后于真空干燥箱中55℃烘干、粉碎、過40目篩，制成洋蔥皮粉備用。

蘆丁標(biāo)品 中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶(60000 U/g) 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

ALC-210.3型電子天平 德國賽多利斯公司；HHS6雙列六孔型電熱水浴鍋、FWl00型高速萬能粉碎機(jī)、KQ-B30型氣流烘干器 北京科偉有限公司； SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科貿(mào)有限公司；DHG-9070A型熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)方程的建立

AlCl3顯色法[13]：精密稱取105℃條件干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)品10mg，用50%乙醇溶解，搖勻，定容至100mL，得到0.1mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為貯備液備用。分別精密吸取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL于25mL比色管中，加入1.5% AlCl38mL和醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5) 4mL，并用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置0.5h。在波長415nm下測吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以顯色液中蘆丁的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：A=31.77x ＋0.006，R2=0.9997。

1.3.2 洋蔥皮總黃酮的制備和含量測定

準(zhǔn)確稱取1g洋蔥皮樣品，加入一定量的纖維素酶和醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，在不同條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。反應(yīng)后將提取液煮沸5min，使酶滅活，過濾。將濾液真空濃縮至原液的1/3，定容至50mL，待測。

取各組不同試驗(yàn)條件下所得的定容樣液1mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的方法，測出其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出提取液中總黃酮的含量，并計(jì)算黃洋蔥皮中總黃酮提取率。

式中：A為吸光度；V1為樣品定容的體積；V2為待測樣液的體積；m為原料質(zhì)量。

1.3.3 洋蔥皮總黃酮酶法提取的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 洋蔥皮總黃酮酶法提取中心組合試驗(yàn)因素水平表Table 1 Variables and their coded levels in CCD design

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定料水比為1:40，選取纖維素酶用量、提取時(shí)間、pH值和提取溫度作為中心組合試驗(yàn)因素，中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design Expert 7.0軟件，見表1。

1.3.4 洋蔥皮總黃酮的抗氧化性研究

本實(shí)驗(yàn)選清除DPPH自由基、·OH的能力以及還原力作為測定洋蔥皮總黃酮抗氧化能力的指標(biāo)，同時(shí)以茶多酚為對照，比較同一質(zhì)量濃度下抗氧化能力的強(qiáng)弱。

1.3.4.1 清除DPPH自由基的測定方法[14-15]

將洋蔥皮總黃酮粗提物稀釋成不同的質(zhì)量濃度梯度，各取2mL不同質(zhì)量濃度的黃酮溶液于試管中，再加入2mL 0.04mg/mL DPPH自由基溶液，混合均勻，反應(yīng)20min，3500r/min離心10min，取上清液在波長517nm處測其吸光度(Ai)；另各取2mL不同質(zhì)量濃度的黃酮溶液于試管中，分別加入無水乙醇2mL，反應(yīng)20min，3500r/min離心10min，取上清液在波長517nm處測其吸光度(Aj)；以2mL 0.04mg/mL DPPH自由基溶液和2mL無水乙醇反應(yīng)做為參比，其吸光度記為A0。計(jì)算黃酮對DPPH自由基的清除率(E)(DPPH自由基)。

1.3.4.2 清除·OH的測定方法[16]

將洋蔥皮總黃酮提取物用雙蒸水配制成不同質(zhì)量濃度梯度，各取2mL不同質(zhì)量濃度的黃酮溶液，依次加入2mL 6mmol/L FeSO4、2mL 6mmol/L H2O2，混勻后靜置10min，再加入2mL 6mmol/L水楊酸，混勻，靜置30min，在波長510nm處測其吸光度(Ai)，當(dāng)用雙蒸水代替水楊酸時(shí)的吸光度(Aj)?？瞻讓φ战M以雙蒸水代替黃酮溶液吸光度(A0)。計(jì)算黃酮對羥自由基的清除率(E)(·OH)。

1.3.4.3 總黃酮還原力的測定[17]

取2.5mL不同質(zhì)量濃度總黃酮溶液，加入0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.6) 2.5mL及含1%鐵氰化鉀水溶液2.5mL，50℃水浴20min后急速冷卻，加入含10%三氯乙酸水溶液2.5mL，于3000r/min離心10min，取上清液5mL，加蒸餾水4mL及含0.1%三氯化鐵水溶液1mL，混勻后10min于波長700nm處測定吸光度。吸光度越大，則說明還原能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

表2 洋蔥皮總黃酮提取中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 CCD arrangement and corresponding experimental results

中心組合試驗(yàn)結(jié)果見表2，采用Design Expert軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到洋蔥皮總黃酮提取率對編碼因素二次多項(xiàng)回歸方程：

由表3可知，P模型＜0.0001，試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著(P= 0.0547＞0.05)，其校正調(diào)整決定系數(shù)R2=0.8885，該模型能解釋88.85%響應(yīng)值的變化，因此該模型擬合程度較好，可以用此模型對酶法提取洋蔥皮總黃酮進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4方程回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明：模型一次項(xiàng)X3(P＜0.01)差異高度顯著；二次項(xiàng)X12、X22、X32和X42(P＜0.0001)差異極顯著，一次項(xiàng)X1、X4(P＜0.05)差異顯著，交互項(xiàng)X2X3、X3X4(P＜0.05)差異顯著。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for total flavonoid yield with various extraction conditions

表4 回歸方程模型系數(shù)顯著性分析Table 4 Variance analysis of fitted regression equation predicting total flavonoids yield

2.2 主因素效應(yīng)分析

在纖維素酶輔助提取情況下，提取溫度對洋蔥皮總黃酮提取率影響最大，其次是加酶量和提取時(shí)間，然后是pH值。

2.3 交互因素效應(yīng)分析

將方程(5)中的任意兩個(gè)因素固定在零水平，對余下的兩個(gè)因素按照所得的二元二次回歸方程進(jìn)行Design Expert軟件編程運(yùn)算，結(jié)果表明交互項(xiàng)X2X3、X3X4作用顯著，其響應(yīng)面及等高線如圖1～2所示，2組圖直觀地反映了各因素對響應(yīng)值的影響。

圖1 pH值(X2)與提取溫度(X3)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Response surface plot showing the effects of pH value and extraction temperature on total flavonoids yield

從圖1可得出：總黃酮提取率隨著pH值的增大先增后減，在pH5.0左右能獲得較高的提取率；總黃酮提取率隨著提取溫度的增大先增后減，在提取溫度50℃左總黃酮的提取率最高。由圖1可以確定最佳水平范圍即pH4.8～5.0，提取溫度為45～50℃。

在pH值的不同水平下，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率改變的變異度不同；在提取溫度的不同水平下，隨著pH值的增加，總黃酮提取率改變的變異度亦不同。

圖2 提取溫度(X3)與提取時(shí)間(X4)對總黃酮提取率的影響Fig.2 Response surface plot showing the effects of extraction temperature and time on total flavonoids yield

通過圖2可得出：總黃酮提取率隨著提取溫度的增大先增后減，在提取溫度50℃左右總黃酮的提取率最高?？傸S酮提取率隨著加酶量的增大先增后減，在加酶量為0.5%左右可以得到較高的提取率。

2.4 最佳提取條件的確定

通過響應(yīng)面回歸方程經(jīng)Design-Expert 7.0軟件分析，得出洋蔥總黃酮最佳提取工藝為加酶量0.524%、pH4.96、提取溫度48.1℃、提取時(shí)間105min、料水比1:40，其提取率預(yù)測可達(dá)到2.26%。實(shí)際中驗(yàn)證以加酶量0.52%、pH5.0、提取溫度48℃、提取時(shí)間105min為提取參數(shù)，得到洋蔥皮總黃酮提取率為2.32%(n=3)，與理論預(yù)測值相比相對誤差＜3%，因此，采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.5 洋蔥皮總黃酮的抗氧化性分析

2.5.1 洋蔥皮總黃酮對DPPH自由基清除效果

圖3 洋蔥皮總黃酮質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率影響曲線Fig.3 Concentration dependent DPPH radical scavenging effect of onion peel flavonoids

從圖3可以看出：在1～10μg/mL 范圍內(nèi)，洋蔥皮總黃酮對清除DPPH自由基有較好的量效關(guān)系。在1～10μg/mL范圍內(nèi)，隨著洋蔥皮總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐步增強(qiáng)。經(jīng)過數(shù)據(jù)模擬曲線的方程得到：洋蔥皮總黃酮清除DPPH自由基的IC50為3.751μg/mL，而茶多酚的IC50為2.976μg/mL，洋蔥皮總黃酮的IC50約是茶多酚的1.3倍。因此，雖然洋蔥皮總黃酮清除DPPH自由基效果稍差于茶多酚，但是洋蔥皮總黃酮仍然表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

2.5.2 洋蔥皮總黃酮對·OH清除效果

圖4 洋蔥皮總黃酮質(zhì)量濃度對·OH清除率影響曲線Fig.4 Concentration dependent hydroxyl radical scavenging effect of onion peel flavonoids

由圖4可看出：10～100μg/mL范圍內(nèi)隨著洋蔥皮總黃酮質(zhì)量濃度的增加其清除·OH的能力增強(qiáng)。在10～40μg/mL范圍內(nèi)，洋蔥皮總黃酮對·OH的清除效果稍高于茶多酚。但隨著質(zhì)量濃度的增大，洋蔥皮總黃酮的清除率顯著高于茶多酚。經(jīng)過數(shù)據(jù)模擬曲線的方程得到：洋蔥皮總黃酮清除·OH的IC50為4.267μg/mL，而茶多酚清除·OH的IC50為1.350μg/mL，洋蔥皮總黃酮的IC50約是茶多酚的3.2倍。

2.5.3 洋蔥皮總黃酮還原力的測定

圖5 洋蔥皮總黃酮的還原力Fig.5 Concentration dependent reducing power of onion peel flavonoids

由圖5可看出，洋蔥皮總黃酮和茶多酚隨質(zhì)量濃度的增大其吸光度逐漸增加，洋蔥皮總黃酮的增大趨勢大于茶多酚，由此可見洋蔥皮總黃酮的還原力極強(qiáng)。經(jīng)SAS分析，洋蔥皮總黃酮的還原力與質(zhì)量濃度呈直線相關(guān)，其回歸方程為：y= 0.0181x＋0.1085，R2=0.9981；茶多酚的還原力也與質(zhì)量濃度呈直線關(guān)系，其回歸方程為：y= 0.0148x＋0.1388，R2=0.9967。因此，洋蔥皮總黃酮還原力強(qiáng)于茶多酚。

3 結(jié) 論

3.1 采用中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)和響應(yīng)面分析分別研究纖維素酶用量、pH值、提取溫度、提取時(shí)間4因素對洋蔥皮總黃酮提取率的影響。洋蔥皮總黃酮提取率的回歸方程為：Y1=2.210-0.078X1-0.039X2-0.110X3-0.095X4＋0.043X1X2-0.017X1X3＋0.002X1X4-0.110X2X3＋0.042X2X4＋0.089X3X4-0.099X12-0.210X22-0.180X32-0.130X42。

3.2 洋蔥皮總黃酮酶法提取最佳工藝為纖維素酶用量0.52%、pH5.0、提取溫度48℃、提取時(shí)間105min、料水比(g/mL)1:40，此條件下洋蔥皮黃酮的提取率可達(dá)到2.32%。3.3洋蔥皮總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基和·OH的能力，其IC50分別為3.751、4.267μg/mL，且洋蔥皮總黃酮對DPPH自由基的抑制能力大于·OH；同時(shí)洋蔥皮黃酮還原能力較強(qiáng)，高于茶多酚。說明洋蔥皮黃酮具有良好的抗氧化作用，是一種天然有效的抗氧化劑。

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Enzymatic Extraction and Antioxidant Activity of Onion Peel Flavonoids

CHEN Jia1，XU Huai-de1,*，MI Lin-feng2，BAO Rong1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China；2. Supervision and Examination Station of Product Quality of Yulin City, Yulin 719000, China)

The central composite design (CCD) method was employed to study the cellulase-assisted extraction process of total flavonoids from onion peel, and their antioxidant activities were also evaluated. The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows: cellulose added at a ratio of 0.52% to hydrolyze onion peel suspended in a 40-fold volume of water adjusted to pH 5.0 for 105 min. The extraction rate of flavonoids under these extraction conditions was 2.32%. Moreover, antioxidation experiments showed that flavoniods from onion peel had very strong scavenging effects on DPPH free and hydroxyl radicasl, and the corresponding IC50values were 3.751μg/mL and 4.267μg/mL. Meanwhile, onion peel flavonoid showed stronger reducing power when compared to tea polyphenols. These findings suggest that onion peel flavonoids are a group of strong antioxidants and have promising application prospects in healthcare foods and drugs.

onion peel；total flavonoids；cellulase；extraction；antioxidant activity

TS255

A

1002-6630(2011)04-0037-05

2010-03-25

陳佳(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取分離。E-mail：chenjia198684@126.com

*通信作者：徐懷德(1964—)，男，副教授，研究方向?yàn)檐涳嬃?、果品蔬菜貯藏與加工、天然產(chǎn)物提取。E-mail：xuhuaide@yahoo.com.cn