張傳軍，劉 超，姜曉坤

薤白抗菌物質(zhì)的提取工藝

張傳軍，劉 超，姜曉坤

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

為優(yōu)化薤白中抗菌物質(zhì)的提取工藝條件，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析方法，以水為提取劑，以金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為響應(yīng)值，確定最佳的薤白抗菌物質(zhì)的水浸提條件：加水量為薤白漿液體積的2倍，32℃提取4次，每次3h。此條件下得到的抗菌物質(zhì)抗菌性較好，進(jìn)行金黃色葡萄球菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，得到抑菌圈直徑達(dá)到13.98mm。證明薤白具有抑菌活性，所提取的抗菌物質(zhì)可以作為天然食品防腐劑。

薤白；抗菌物質(zhì)；提取

薤白(Allium macrostemon Bunge)為百合科蔥屬多年生草本植物，又名“野蒜”、“小蒜”，是一種安全、無(wú)毒的食用野菜，在我國(guó)大部分省份均有分布。其鱗莖上屜蒸至半熟后曬干或烘干入藥稱作薤白。薤白中含有多種生物活性成分[1]，可通陽(yáng)開(kāi)痹、溫中理氣、健胃整腸，并具有抗菌消炎的作用。用該屬植物制備的天然保鮮劑進(jìn)行蔬菜保鮮已有報(bào)道，如張恒[2-3]用大蒜提取物保鮮蔬菜，王展華[4]采用洋蔥精油對(duì)馬鈴薯、蓮藕進(jìn)行保鮮研究，均取得了較好的效果，但以薤白為原料制備保鮮劑尚未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)報(bào)道[6-8]薤白具有廣譜的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌及根霉、木霉、曲霉、酵母菌等真菌都顯示出良好的抑制作用，而且具有較好的熱穩(wěn)定性[9-10]。為此，本研究選擇具有抑菌防腐作用的野生藥食同源植物薤白為材料制備天然保鮮劑，全面系統(tǒng)地研究薤白的抑菌活性，以期為開(kāi)發(fā)純天然、無(wú)污染的植物源防腐劑提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

薤白于7月中旬采自吉林市左家鎮(zhèn)山區(qū)。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；培養(yǎng)基：牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基；所用試劑均為分析純。

DH300電熱恒溫培養(yǎng)箱、BS-1E數(shù)顯全溫振蕩培養(yǎng)箱 常州華普達(dá)儀器制造廠；LDZX-50KBS自動(dòng)控制不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海茸研儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水浸提工藝確定

1.2.1.1 薤白預(yù)處理[11]

將新鮮薤白洗凈，用75%酒精消毒后切段，用組織搗碎機(jī)打成勻漿后備用。

1.2.1.2 薤白水提液的制備

水是一種強(qiáng)的極性溶劑，薤白中親水性的抗菌成分能被水溶出。為有效提取薤白的抗菌物質(zhì)，可將薤白的水提液濃縮至一定體積后，向其中加入95%的乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%，靜置24h，過(guò)濾去除雜蛋白，濾液濃縮，得到薤白水提液。

采用單因素試驗(yàn)考察不同加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)、浸提溫度對(duì)薤白抗菌物質(zhì)的得率及抗菌性的影響。

1.2.1.3 加水量的確定

精確稱取5份薤白各20g，打漿，在20℃，分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0倍量(V/V)薤白的蒸餾水提取3次，提取時(shí)間3h，重復(fù)3次。水提液濃縮至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根據(jù)抗菌能力的結(jié)果確定加水量。

1.2.1.4 提取時(shí)間的確定

在加水量確定的條件下，精確稱取5份薤白各20g，打漿，在20℃加入蒸餾水進(jìn)行提取，提取時(shí)間分別為0.5、1.0、2.0、3.0h和4.0h。水提液濃縮至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根據(jù)抗菌能力的結(jié)果確定提取時(shí)間。

1.2.1.5 提取次數(shù)的確定

在加水量及提取時(shí)間確定的條件下，精確稱取4份薤白各20g，在20℃加入蒸餾水，分別提取1、2、3、4次。水提液濃縮至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根據(jù)抗菌能力的結(jié)果確定提取次數(shù)。

1.2.1.6 提取溫度的確定

在加水量及提取時(shí)間確定的條件下，精確稱取5份薤白各20g，加入蒸餾水，分別在15、20、25、30、35℃，提取3次。水提液濃縮至20mL后，制成1g/mL薤白水提液，根據(jù)抗菌能力的結(jié)果確定最佳提取溫度。

1.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 菌種活化

細(xì)菌接入對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2.2.2 菌懸液或孢子懸液的制備

在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取活化后的菌體或孢子，放入50mL無(wú)菌生理鹽水中振蕩搖勻，制成菌懸液或孢子懸液。

1.2.2.3 抗菌效力的測(cè)定[1,12-14]

用打孔器將定性濾紙加工成直徑10mm圓形濾紙片放入干燥平皿中，于121℃干熱滅菌20min，冷卻后放入薤白水浸提液中浸泡10min，于無(wú)菌操作臺(tái)上晾干。配制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌固體培養(yǎng)基，121℃濕熱滅菌30min，冷卻后倒平板。在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌棉簽蘸取0.5mL菌懸液均勻涂布于平板上，再用無(wú)菌鑷子夾取浸有供試液的濾紙3片，間隔一定距離貼在含菌平板上，然后將各平皿分別置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(37℃、24h)，測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次取平均值。1.3薤白抗菌物質(zhì)提取條件優(yōu)化[15-17]

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)薤白抗菌物質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以浸提的液料比、時(shí)間、浸提次數(shù)、提取溫度為自變量，采用Minitab 15軟件，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素中心復(fù)合響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共31組試驗(yàn)，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 加水量的確定由表1可知，隨著加水量的增加，薤白抗菌物質(zhì)的抑菌圈直徑有所增加，即抗菌能力增強(qiáng)。這主要是由于隨著水的增多，水與薤白漿液充分接觸，而將其中的抗菌物質(zhì)不斷從細(xì)胞中溶出，當(dāng)加水量大于2倍時(shí)，達(dá)到較好的抑菌效果，此后，雖然加水量持續(xù)增加而抑菌圈直徑增加不明顯，趨于平緩。同時(shí)，薤白抗菌物質(zhì)對(duì)于金黃色葡萄球菌的抵抗能力要大于其對(duì)大腸桿菌的抑制能力。綜上所述，可將加水量確定為薤白勻漿體積的2倍量。

表1 不同加水量對(duì)薤白抗菌能力的影響Table 1 Effect of water amount on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

2.1.2 提取時(shí)間的確定

表2 不同浸提時(shí)間對(duì)薤白抗菌能力的影響Table 2 Effect of extraction time on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

由表2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，薤白水提液的抑菌圈直徑增加，而抑菌圈在3.0h之后趨于平緩，這是由于薤白中抗菌物質(zhì)在水中溶解度較好，一定時(shí)間內(nèi)即可以浸提出大部分的抗菌物質(zhì)，如果再延長(zhǎng)浸提時(shí)間，其抑菌效果趨于一定值，不會(huì)有明顯變化。因此可將提取時(shí)間確定為3h。

2.1.3 提取次數(shù)的確定

表3 不同提取次數(shù)對(duì)薤白抗菌能力的影響Table 3 Effect of extraction number on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

由表3可知，薤白水提液的抑菌能力隨著提取次數(shù)的增加而有所增加，3次提取與4次提取的抑菌效果已無(wú)明顯差異，主要是由于本試驗(yàn)是在加水量及提取時(shí)間確定后完成的，薤白中的抗菌物質(zhì)基本上已經(jīng)完全溶入溶液中，因此提取3次之后無(wú)明顯的變化，由此可將提取次數(shù)確定為3次。

2.1.4 提取溫度的確定

表4 不同提取溫度對(duì)薤白抗菌能力的影響Table 4 Effect of extraction temperature on anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities of aqueous extract from Allium macrostemon Bunge

由表4可知，薤白水提液的抑菌能力隨著提取溫度的升高而有所增加，主要是由于升高溫度有助于有效抗菌物質(zhì)的溶出，但是溫度過(guò)高，影響抗菌效果，由此可將提取溫度確定為25℃。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析，經(jīng)過(guò)比較，薤白水提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，因此采用其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑作為指標(biāo)，設(shè)計(jì)因素水平編碼見(jiàn)表5。

表5 薤白抗菌物質(zhì)提取響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 5 Coded values and corresponding actual values of variables in response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

利用Minitab 15軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 薤白抗菌物質(zhì)提取響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental scheme for response surface analysis and corresponding experimental data

表7 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 7 Significance test of each regression coefficient of the established regression equation with anti-Staphyloccocus aureus circle diameter as a function

利用Minitab 15軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行因素分析，顯著檢驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

由表8可知，總回歸系數(shù)R2為0.9524，決定系數(shù)R2Adj為0.9268。從分析中可以得出，回歸模型P＜0.05，說(shuō)明模型顯著，得到二元多次回歸模型：

由顯著性分析可知，模型顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.9524，說(shuō)明擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，因此可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)薤白抗菌物質(zhì)的水浸提工藝條件。

經(jīng)Minitab 15軟件分析得2因素響應(yīng)面及其等高線圖，其中提取時(shí)間(X2)、提取溫度(X4)及其交互作用顯著，如圖1所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，抑菌圈直徑存在最大值。對(duì)所得回歸方程求導(dǎo)，得到抑菌效果最佳時(shí)的薤白抗菌物質(zhì)水浸提條件：加水量為薤白漿液的1.98倍，在31.5℃提取3.5次，每次3.3h，此條件下，薤白水提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到14.25mm。

表8 回歸模型的方差分析Table 8 Variance analysis of the established regression equation with anti-Staphyloccocus aureus circle diameter as a function

圖1 抑菌圈直徑與提取溫度、提取時(shí)間的等高線和響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface and contour plot showing the effects of extraction temperature and time on anti-Staphyloccocus aureus circle diameter

2.2.3 回歸模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析得到的優(yōu)化薤白水浸提條件：加水量為薤白漿液的2倍，在32℃提取4次，每次3h，在此條件下，得到的金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為13.98mm，與模型預(yù)測(cè)值14.25mm之間的誤差小于5%。薤白水浸提工藝條件經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析方法的優(yōu)化，得到最佳條件。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析方法，對(duì)薤白中抗菌物質(zhì)的水浸提工藝流程進(jìn)行優(yōu)化，最終確定水浸提工藝為加水量為薤白漿液的2倍，在32℃提取4次，每次3h，所得到的抗菌物質(zhì)的抗菌性較好，進(jìn)行金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)，得到抑菌圈直徑達(dá)到13.98mm。抑菌效果明顯，為天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)和利用提供了參考。

[1]張卿, 高爾. 薤白的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2003, 28(2): 105-107.

[2]張恒. 生姜大蒜提取物保鮮蔬菜[J]. 食品科技, 2006(1): 114-117.

[3]張恒. 用大蒜及其提取物保鮮蔬菜研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 33 (6): 1062-1063; 1086.

[4]王展華. 洋蔥精油提取分析及保鮮效果研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007: 26-40.

[5]張香美, 劉煥云, 王春霞, 等. 薤白抑菌作用的初步研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 33(9): 1676-1677.

[6]陳錫雄. 薤白抑菌作用的初步研究[J]. 杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2004, 3(4): 337-340.

[7]EFTEKHAR F, NARIMAN F, HABIBI Z, et al. Antibacterial activity of the aerial extracts from Xanthium brasilicum[J]. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2007, 6(1): 65-68.

[8]TODA M, OKUBO S, OHNISHI R, et al. Antibacterial and bactericidal activities of Japanese green tea[J]. Nippon Saikingaku Zasshi, 1989: 44 (4): 669-672

[9]史德芳. 仙人掌提取物的分離及其抑菌性能的研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2006.

[10]王杰. 苦瓜的抑菌作用及其活性物質(zhì)的提取分離研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2004.

[11]QI Liyan, LIU Lili, YU Pingru, et al. Preliminary studies on antifungal activity of Xanthium sibiricum and the endophytic fungi[J]. Agricultural Science and Technology, 2008, 9(4): 144-148.

[12]范秀容, 李廣武, 沈萍. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 高等教育出版社, 1998: 144-147.

[13]姚淑敏. 蘆薈提取物抑菌作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(4): 137-139.

[14]慕立義. 植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1994: 79-81.

[15]晏衛(wèi)紅, 黃思良, 丘華. 蘆薈對(duì)植物病原真菌生長(zhǎng)的抑制效果[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2001, 17(5): 37-40.

[16]LI Yalei, LUO Ruiming. Antibacterial effect of extracts from Allium mongolicum Regel[J]. Agricultural Science and Technology, 2008, 9 (4): 123-126.

[17]REES L P, MINNEY S F, PLUMMER N T, et al. A quantitative assessment of the anti-microbial activity of garlic(Allium sativum)[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1993, 9(3): 303-307.

Process Optimization for Aqueous Extraction of Anti-Staphyloccocus aureus Substances from Allium macrostemon Bunge

ZHANG Chuan-jun，LIU Chao，JIANG Xiao-kun
(School of Food Technology, Jilin Agricultural Science and Technology College, Jilin 132101, China)

Previous studies have showed that Allium macrostemon Bunge is a broad-spectrum antimicrobial plant. In the present study, crude aqueous extracts isolated from Allium macrostemon Bunge under different levels of water amount as well as extraction time, temperature and number were tested comparatively for their anti-Escherichia coli and anti-Staphyloccocus aureus activities, and the plant showed better inhibitory effect against Staphyloccocus aureus than against anti-Escherichia coli. To obtain highly active anti-Staphyloccocus aureus substances from Allium macrostemon Bunge, the above four extraction conditions were optimized by response surface methodology based on inhibition circle diameter against Staphyloccocus aureus. The optimum levels of water amount as well as extraction time, temperature and number were determined to be 2-fold volume, 3 h (each time), 32 ℃ and 4, respectively, and under these conditions an extract with an inhibition circle diameter of 13.98 mm was obtained. Therefore, Allium macrostemon Bunge has the potential to be developed into a natural food preservative.

Allium macrostemon Bunge；antibacterial substance；extraction

TQ455.5

A

1002-6630(2011)04-0078-04

2010-09-13

張傳軍(1958—)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)副產(chǎn)品深加工。E-mail：zhangchuanjun502@126.com