軟棗獼猴桃總黃酮含量測定的方法研究

欒云峰，王 菲，劉長江*，宗緒巖

軟棗獼猴桃總黃酮含量測定的方法研究

欒云峰，王 菲，劉長江*，宗緒巖

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

選用ZrOCl2比色法、NaNO2-Al(NO3)3比色法、AlCl3比色法以及HPLC法測定軟棗獼猴桃總黃酮含量，通過對黃酮粗提液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與不同顯色劑反應(yīng)后進(jìn)行200～600nm波長掃描，根據(jù)掃描結(jié)果確定各種反應(yīng)的適合波長并進(jìn)行定量分析比較。結(jié)果表明，NaNO2-Al(NO3)3比色法與AlCl3比色法不適合軟棗獼猴桃總黃酮測定。在284nm波長處，ZrOCl2比色法的線性方程Y=0.0114X-0.0001，R2=0.9991，平均加樣回收率為99.4%，RSD=1.61%(n=5)。ZrOCl2比色法是一種快捷、準(zhǔn)確的檢測方法，適用于軟棗獼猴桃總黃酮含量測定。

軟棗獼猴桃；總黃酮；比色法

軟棗獼猴桃(Actinidia arguta Sieb.et Zucc.)，又名軟棗子，獼猴梨，藤瓜，屬于獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)多年生落葉藤本植物[1-2]。果實可食用，多汁，酸甜適口，風(fēng)味獨特。營養(yǎng)價值很高，含大量VC、VB族維生素、氨基酸、類胡蘿卜素等多種營養(yǎng)成分。

黃酮類化合物是一類植物中分布很廣而且重要的多酚類天然產(chǎn)物，泛指兩個具有酚羥基的苯環(huán)(A-與B-環(huán))通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物[3]。的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果以及抵御異物的侵襲起著重要作用。黃酮化合物有具有廣泛的藥理活性，如抗菌作用、抗氧化作用和抗自由基作用[4]。

目前測定食品及中草藥中黃酮類的方法有直接測定法[5]、AlCl3法[6-8]、Al(NO3)3法[9-10]、紫外法[11]、HPLC[12-13]法等。有關(guān)食品及中草藥中黃酮類的含量測定，當(dāng)前用得較多的方法之一是以蘆丁為標(biāo)樣的NaNO2-Al(NO3)3顯色法，但是此反應(yīng)并不專一，很多非黃酮類物質(zhì)也可參與反應(yīng)對測定結(jié)果產(chǎn)生影響[14]。本實驗以蘆丁為標(biāo)樣，通過分析研究，確定適合軟棗獼猴桃黃酮類測定的簡便方法，為軟棗獼猴桃這一野生資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃 遼寧省本溪市。

蘆丁(rutin)、槲皮素(quercentin) 中國藥品生物制品鑒定所；甲醇(色譜純) Dikma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

600E-2487高效液相色譜儀 美國Waters公司；Waters Nova-pak C1860A 4μm 3.9mm×150mm色譜柱；TU-180型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；移液器 德國Eppendorf公司；himac CR-21G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；BP120S 電子天平 德國Sartorius公司；JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 軟棗獼猴桃黃酮提取

取軟棗獼猴桃鮮果100g，勻漿，加入勻漿4倍體積70%(V/V)乙醇超聲處理，超聲功率300W，超聲時間25s，間隔10s，作用30次，超聲處理后60℃水浴2h，冷卻后4℃ 10000r/min離心15min，取上清液備用。1.3.2不同顯色反應(yīng)反應(yīng)液的紫外-可見光譜掃描

分別將不同顯色反應(yīng)的蘆丁及粗提樣品反應(yīng)液進(jìn)行200～600nm波長掃描，以確定檢測波長。

1.3.3 粗提液中總黃酮含量的測定

ZrOCl2比色法[15]：取0.5mL黃酮粗提液置于比色管中，加入甲醇至5mL，再加入質(zhì)量濃度2g/mL ZrOCl2甲醇溶液1.5mL，以甲醇定容至10mL，靜置10min測定A284nm、A430nm。

AlCl3比色法[6-8]：取1mL黃酮粗提液置于比色管中，加入質(zhì)量濃度1.5g/100mL AlCl3-50%乙醇溶液8mL，以50%乙醇定容至25mL，靜置30min后測定A279nm、 A315nm。

NaNO2-Al(NO3)3比色法[9-10]：取1mL黃酮粗提液置于比色管中，加入30%乙醇至10mL，加入1mL質(zhì)量濃度5g/mL NaNO2溶液，搖勻，靜置6min，加入1mL質(zhì)量濃度10g/mL Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6min，加入5g/mL NaOH溶液10mL，以30%乙醇定容至25mL，靜置15min后測定A330nm、A510nm。

HPLC法[12-13]：流動相：甲醇-水-1%磷酸梯度洗脫；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：350nm；進(jìn)樣量：10μL。取黃酮粗提液20mL，加入3mol/L HCl溶液 3mL，80℃冷凝回流2h，冷卻，用堿中和，減壓蒸干，定容至5mL，取10μmL進(jìn)行HPLC測定。以槲皮素為外標(biāo)，計算粗提液中黃酮含量。

每種檢測方法均做4組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

ZrOCl2比色法波長掃描結(jié)果見圖1。蘆丁在219、280、430nm有吸收峰，黃酮粗提液在273、284nm處有吸收峰。284nm處蘆丁與粗提物的吸收峰基本吻合，選擇為檢測波長；在可見區(qū)蘆丁與黃酮粗提液的吸收峰不吻合，選擇蘆丁的吸收峰處430nm作為參考。

圖1 ZrOCl2顯色法在波長200～600nm處的光譜掃描圖Fig.1 Ultraviolet scanning of flavonoid extracts and rutin for ZrOCl2colorimetric determination

圖2 AlCl3顯色法在波長200～600nm處的光譜掃描圖Fig.2 Ultraviolet scanning of flavonoid extracts and rutin for AlCl3colorimetric determination

AlCl3比色法波長掃描結(jié)果見圖2。蘆丁在210、273、415nm處有吸收峰，黃酮粗提液在233、279nm處有吸收峰。279nm處蘆丁與粗提物的吸收峰基本吻合，選擇為檢測波長；在可見區(qū)蘆丁與黃酮粗提液的吸收峰不吻合，選擇蘆丁的吸收峰處415nm作為參考。

圖3 NaNO2-Al(NO3)3顯色法在波長200～600nm處的光譜掃描圖Fig.3 Ultraviolet scanning of flavonoid extracts and rutin for NaNO2-Al(NO3)3colorimetric determination

由圖3可知，400～600nm范圍內(nèi)，蘆丁在504nm處有一不明顯的吸收峰，黃酮粗提液在492nm處有明顯的吸收峰；280～400nm范圍內(nèi)，蘆丁在367、352、340、330、320nm處有吸收峰，黃酮粗提液在339、363、330、287nm處有吸收峰；波長小于280nm，蘆丁與黃酮粗提液吸收峰非常雜亂，并且吸收較弱。330nm處處蘆丁與粗提物的吸收峰基本吻合，選擇為檢測波長；在可見區(qū)蘆丁與黃酮粗提液的吸收峰不吻合，選擇標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰處510nm作為參考。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

ZrOCl2比色法：分別取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，按1.3.3節(jié)ZrOCl2比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定A284nm、A430nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：Y284=0.0114X-0.0001，R2=0.9991；Y430=0.008X＋0.0001，R2=0.9992。

AlCl3比色法：分別取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5mL，按1.3.3節(jié)AlCl3比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定A279nm、A315nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：Y279=0.0316X-0.0006，R2=0.9996；Y415=0.0315X-0.0002，R2=0.9999。

NaNO2-Al(NO3)3比色法：分別取0.2mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2、2.5mL，按1.3.3節(jié)NaNO2-Al(NO3)3比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定A330nm、A492nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：Y330=0.0196X＋0.0019，R2=0.9416；Y510=0.0727X＋0.0004，R2=0.9999。NaNO2-Al(NO3)3比色法在330nm處的吸收很不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差，不適合進(jìn)行黃酮含量測定。

HPLC法：配制0.2mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)，以峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y=2×10-7X＋0.1292，R2=0.9938。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見圖4、5。

圖4 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.4 Chromatogram of quercetin standard

圖5 樣品HPLC圖譜Fig.5 Chromatogram of sample

2.3 不同檢測方法的比較

表1 不同顯色方法測定軟棗獼猴桃粗提液中總黃酮含量的比較Table 1 Comparison of total flavonoid contents in Actinidia arguta extract determined by different colorimetric methods

比色法測定的粗提液中總黃酮含量，結(jié)果見表1。通過3種比色方法與HPLC法比較可知，ZrOCl2法在430nm處、AlCl3法在415nm處測得量明顯低于HPLC法，Al(NO3)3法在492nm處、AlCl3法在279nm處測得量明顯高于HPLC法，ZrOCl2法在284nm處測得量與HPLC法基本吻合。

NaNO2-Al(NO3)3法目前是在食品和中草藥測定黃酮類時，用的較多的方法之一，NaNO2-Al(NO3)3顯色法發(fā)生在黃酮分子B環(huán)的3＇,4＇-鄰二酚羥基部位，很多非黃酮類物質(zhì)如原兒茶醛、原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸、苯甲酸類、肉桂酸類及原花色素等多種物質(zhì)均具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)并在500nm左右有最大吸收或有較強(qiáng)吸收[12]，對測定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。經(jīng)此方法測定的軟棗獼猴桃總黃酮含量明顯偏高，此方法不適用于測定軟棗獼猴桃總黃酮。黃酮分子B-環(huán)中存在游離的3-OH或5-OH時，均可與ZrOCl2形成黃色螯合物[3-4](圖6)，AlCl3能使黃酮化合物B-環(huán)的3-OH或5-OH與4-羰基形成比較穩(wěn)定的螯合物，這兩種化合物與黃酮的反應(yīng)均有較好的選擇性，但AlCl3法仍然不能很好的排除干擾，顯然ZrOCl2法更適合軟棗獼猴桃總黃酮的測定。

圖6 黃酮與ZrOCl2形成配合物的結(jié)構(gòu)Fig.6 Reaction mechanism between flavonoids and ZrOCl2

2.4 ZrOCl2比色法的方法評價

2.4.1 精密度實驗

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL，樣品溶液0.4mL各5份，同1.3.3節(jié)中ZrOCl2比色法操作，測定吸光度。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度的RSD=0.71%(n=5)，樣品吸光度的RSD=1.07%(n=5)，說明精密度良好。精密度實驗結(jié)果見表2。

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Results of precision experiments

2.4.2 穩(wěn)定性實驗

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0mL，樣品溶液0.4mL，同1.3.3節(jié)ZrOCl2比色法操作在0、10、20、30、45、60、90、120min測定其吸光度。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)品在120min內(nèi)穩(wěn)定，樣品在60min內(nèi)基本穩(wěn)定。穩(wěn)定性實驗結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 Results of stability experiments

2.4.3 加標(biāo)回收率實驗

分別取已知濃度的粗提液1mL與5個比色管中，向每個比色管中加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3節(jié)中ZrOCl2比色法測定含量并計算加標(biāo)回收率。

表4 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 4 Results of recovery rate experiments

3 結(jié) 論

通過對黃酮粗提液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與不同顯反應(yīng)后進(jìn)行200～600nm波長掃描結(jié)果分析，確定各種顯色反應(yīng)的適合波長，并以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品峰值作為參考值。將NaNO2-Al(NO3)3法、ZrOCl2法、AlCl3法定量分析結(jié)果與HPLC測定結(jié)果比較，其中ZrOCl2法測定結(jié)果與HPLC測定結(jié)果基本一致。通過比較分析，得到了ZrOCl2比色法(測定波長為284nm)與HPLC法之間的校正系數(shù)為0.89。HPLC法雖然可以較準(zhǔn)確地測定總黃酮含量，但對設(shè)備和操作要求較高，計算繁瑣。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的ZrOCl2比色法是一種操作簡便、結(jié)果較準(zhǔn)確的方法，可用于軟棗獼猴桃總黃酮類含量的快速測定。

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A Comparative Study of Different Methods for the Determination of Total Flavonids in Actinidia arguta

LUAN Yun-feng，WANG Fei，LIU Chang-jiang*，ZONG Xu-yan
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Total flavonoids in Actinidia arguta were determined separately by ZrOCl2 colorimetry, NaNO2-Al(NO3)3 colorimetry, AlCl3colorimetry and HPLC. Wavelength scanning of flavonoid extracts and rutin after reaction with different chromogenic reagents was performed in a range of 200-600 nm. Results showed that NaNO2-Al(NO3)3colorimetry and AlCl3colorimetry were fount not suitable for the determination of total flavonoids in Actinidia arguta. An excellent linear equation for ZrOCl2 colorimetric determination at 284 nm wavelength was obtained as follows: Y284 = 0.0114X-0.0001, R2= 0.9991. The average recovery rate was 99.4% with a RSD of 1.61% (n = 5). ZrOCl2colorimetry is a quick accurate method for the determination of total flavonoids in Actinidia arguta.

Actinidia arguta；total flavonoids；colorimetry

S663.4

A

1002-6630(2011)04-0155-04

2010-03-20

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(200903013)

欒云峰(1986—)，男，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：fluyuan@126.com

* 通信作者：劉長江(1955 —)，男，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：liucj597@sohu.cm