染料木黃酮抑制血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活化及蛋白激酶K活性

韓彬，程道梅，余小平＊，彭曉莉，賈皓

（1.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563003；2.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 610083）

血管生成對實(shí)體瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的活化和腫瘤細(xì)胞直接參與 實(shí) 體 腫 瘤 的 血 管 生 成［1－3］。 染 料 木 黃 酮（genistein，Gen）是一種重要的非營養(yǎng)素，屬于異黃酮類，主要存在于大豆及其制品中。目前，針對Gen的功效研究主要集中于腫瘤、心血管疾病和女性絕經(jīng)綜合征的化學(xué)預(yù)防［4］。前期研究顯示，Gen在體內(nèi)外均可通過抑制HER－2／neu受體磷酸化和蛋白激酶K（PTK）活性［5］下調(diào)促血管生成因子的表達(dá)，但有關(guān)Gen抗血管生成作用的分子機(jī)制仍不十分清楚。ECs參與實(shí)體腫瘤的血管生成［6］，本研究旨在評估Gen對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的ECs活化的影響，揭示Gen抗血管生成的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

染料木黃酮、VEGF購自北京Yahui生物醫(yī)學(xué)工程公司；PTK活性分析試劑盒、Caspase－3活性分析試劑盒、Annexin V－FITC凋亡試劑盒購自美國Promega公司；特級胎牛血清購自Hyclone公司；ECs生長添加劑ECGS、抗體F－3520購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)和處理收集健康非異常妊娠母親經(jīng)陰道所產(chǎn)健康胎兒的新鮮臍帶，分離 HUVECs，在含有20%特級胎牛血清、100U／ml盤 尼 西 林、100μg／ml鏈 霉 素 和75μg／ml ECGS的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)鵝卵石樣形態(tài)以及免疫細(xì)胞化學(xué)方法（ECs特異抗體，F(xiàn)－3520）鑒定為ECs。將第3～6代的細(xì)胞接種于24孔板，分別用5μg／ml VEGF單獨(dú)處理或VEGF（5μg／ml）外加1、10、100μmol／L Gen處理24h。用等量的二甲基亞楓（DMSO）替代VEGF和（或）Gen處理作為對照組。細(xì)胞培養(yǎng)基中DMSO的終濃度≤0.1%（v／v）。

1.2.2 細(xì)胞凋亡和死亡分析 采用Caspase－3活性分析試劑盒和Annexin V－FITC凋亡試劑盒對凋亡情況進(jìn)行定量分析，通過錐蟲藍(lán)不相容試驗(yàn)對HUVECs的細(xì)胞毒性和死亡情況進(jìn)行量化分析。

1.2.3 PTK活性分析 將HUVECs在蛋白緩沖液中4℃下溶解20min。緩沖液組成：1%Triton X－100、0.32mol／L 蔗 糖、5mmol／L 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）、1mmol／L 苯 甲 基 磺 酰 氟 （PMSF）、1μg／ml抑肽酶、2mmol／L 二硫蘇 糖醇 （DTT）、10mmol／L Tris－Cl、pH 8.0。采用 Bradford方法測定蛋白的總濃度，嚴(yán)格按照PTK活性分析試劑盒說明書操作測定PTK活性，結(jié)果表示為pmol／min／μg蛋白。

2 結(jié)果

2.1 Gen誘導(dǎo)VEGF處理的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和死亡

VEGF單獨(dú)使用或與DMSO聯(lián)合使用處理HUVECs 24h，其凋亡細(xì)胞死亡情況沒有明顯差異（圖1）。與對照組相比，1μmol／L Gen處理組的ECs凋亡率（圖1A）和Caspase－3活力（圖1B）分別增加了1.81和1.72倍，與VEGF處理組相比，兩者分別增加了2.01和2.02倍。Gen處理導(dǎo)致凋亡率（圖1A）和Caspese－3活力（圖1B）呈劑量依賴型提高，提示Gen可誘導(dǎo)ECs凋亡，錐蟲藍(lán)法分析ECs死亡情況也得到相似的結(jié)果。Gen處理的HUVECs死 亡 率 從 （4.42±0.98）% 提 高 到（11.35±1.52）%，而 VEGF處理的 HUVECs死亡率未見提高（圖1C）。

2.2 Gen抑制VEGF處理的內(nèi)皮細(xì)胞的PTK活性

已有研究報道，Gen對PTK活性有較強(qiáng)的抑制作用［4，7］。為檢測Gen對ECs中PTK活性是否有抑制作用，實(shí)驗(yàn)將5μg／L VEGF單獨(dú)使用或?qū)⑵渑cGen（1、10、100μmol／L）聯(lián)合使用處理HUVECs 24h后，用PTK活性分析試劑檢測PTK活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，單用VEGF能使PTK基礎(chǔ)活性提高1.3倍，1μmol／L Gen處理的ECs中，PTK活性分別較對照組下降0.82倍，較VEGF處理組下降0.65倍。添加Gen（1～100μmol／L）以劑量依賴方式降低HUVECs中PTK活性，提示Gen可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的PTK活性。

3 討論

本研究的主要結(jié)果顯示，Gen作為強(qiáng)效的PTK抑制劑［7］，抑制VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化，這可能是Gen抗血管生成作用的可能機(jī)制之一。異黃酮作為大豆中的非營養(yǎng)素成分，廣泛存在于人類膳食中，如大豆及各種水果蔬菜，因此我們通過植物性膳食即可攝入大量的異黃酮［8，9］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，大豆異黃酮在降低亞洲人乳腺癌和前列腺癌的發(fā)生率中發(fā)揮重要作用［4，10］。Gen（4，5，7三羥異黃酮）為大豆產(chǎn)品中主要的異黃酮，在動物模型中能夠抑制癌癥發(fā)生［11］。新近文獻(xiàn)報道，Gen對人類癌癥細(xì)胞生長的抑制作用是通過調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期和凋亡有關(guān)的基因來實(shí)現(xiàn)的［12－14］。

體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究表明，Gen是一種有潛力的用于癌癥化學(xué)預(yù)防的物質(zhì)，因其具有抗輻射和抗腫瘤耐藥性而可用于癌癥的輔助治療［4］。前期的研究發(fā)現(xiàn)，Gen作為強(qiáng)效的PTK活性抑制劑，可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平下調(diào)促血管生成因子VEGF、MMPs，uPA 的表達(dá)［5］，提示 Gen可能還有許多尚未被發(fā)現(xiàn)的病理生理功能。大量研究證實(shí)，實(shí)體瘤中的腫瘤血管生成是一個復(fù)雜、有序的過程，包括促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡［15－17］。而VEGF在實(shí)體瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，盡管這一相互作用在一些特定腫瘤細(xì)胞類型的不同生長階段表現(xiàn)出顯著的差異性［18］。然而有關(guān)VEGF對ECs，尤其是對HUVECs中的信號通路的影響少有報道。正常成人的血管ECs是高度分化、相對靜止的。其活化和增殖是血管生成的起始階段。本研究明確顯示，HUVECs經(jīng)VEGF處理后，內(nèi)皮細(xì)胞PTK活性提高，進(jìn)而可能引起下游增殖信號分子的活化及磷酸化并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Gen處理以劑量依賴方式降低VEGF誘導(dǎo)的HUVECs PTK活性，升高凋亡率及蛋白激酶－3活性。本研究結(jié)果提示，Gen可抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的PTK活性，該結(jié)果與 Yoon等［19］發(fā)現(xiàn) Gen作為PTK活性抑制劑抑制增殖活性及引起凋亡的假說一致。綜合顯示Gen具有抗血管生成作用，為其用于腫瘤轉(zhuǎn)移及其他血管增生性疾病的治療提供了新的思路。

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