表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)容積超負(fù)荷導(dǎo)致的大鼠心肌肥厚的改善作用

賈皓，余小平，程道梅，彭曉莉

（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 610083）

心肌肥厚是心臟應(yīng)對(duì)血液動(dòng)力超負(fù)載而發(fā)生的一種代償機(jī)制［1］，盡管心肌細(xì)胞的肥厚在初期可以補(bǔ)償一定程度的心臟功能的缺失，但長(zhǎng)期持續(xù)的心肌肥厚最終會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病、心力衰竭甚至猝死［2，3］。

流行病學(xué)研究顯示，綠茶提取物中的多酚類等天然抗氧化劑可以降低冠心病的死亡率［4］。作為綠茶提取物中重要的茶多酚的一種，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（Epigallocathechin－3Gallate，EGCG）被報(bào)道具有心血管系統(tǒng)的保護(hù)效應(yīng)。EGCG通過(guò)阻斷氨基端激酶（JNKs）信號(hào)通路從而抑制了Angiotensin II誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的肥厚［5］，但EGCG針對(duì)心肌肥厚的效果的報(bào)道卻較為罕見(jiàn)。故而在本研究中，我們采用經(jīng)口給藥的方式，探究EGCG對(duì)于容積超負(fù)荷誘發(fā)的心肌肥厚的預(yù)防效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在實(shí)驗(yàn)期間，EGCG被連續(xù)的供給各實(shí)驗(yàn)組，然而對(duì)照組被提供相同的不含EGCG的飲用水。具體設(shè)計(jì)如下（圖1）。

1.2 活體心肌肥厚模型

Spregue－Dawley大鼠麻醉后，實(shí)施開(kāi)腹手術(shù)，暴露出腹主動(dòng)脈與腔靜脈，將一支18G的針頭插入主動(dòng)脈內(nèi)，然后從動(dòng)脈的內(nèi)側(cè)壁貫穿入腔靜脈，通過(guò)同一路徑反復(fù)貫穿幾次，以確保貫穿通路的尺寸。腹部動(dòng)脈針頭插入的位置采用氰基丙烯酸鹽粘合劑重新封起后，縫合大鼠的腹部。

1.3 離體心臟缺血／復(fù)灌（I／R）模型制備

大鼠稱重?cái)囝^后開(kāi)胸取出心臟，迅速轉(zhuǎn)移，固定于Langendorff灌流裝置，以95%O2＋5%CO2混合氣體飽和的K－H液，行76mm Hg（1mmHg＝0.133kPa）恒壓灌流，用6－0醫(yī)用無(wú)損傷縫合線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左前降支以備結(jié)扎。各組大鼠心臟穩(wěn)定20min后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，給藥后用縫合線結(jié)扎冠脈（觀察心外膜電圖，以結(jié)扎后出現(xiàn)明顯R波高聳或ST段抬高為冠狀動(dòng)脈結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn)），行缺血30min，再松開(kāi)縫合線進(jìn)行復(fù)灌（觀察心外膜電圖，以松開(kāi)縫合線后出現(xiàn)抬高的ST段下降50%以上為復(fù)灌成功的標(biāo)準(zhǔn)）15min。缺血及復(fù)灌期間如出現(xiàn)不可逆心室顫動(dòng)則不納入樣本。

1.4 標(biāo)本的采集和處理

各組大鼠按照設(shè)定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材，切取心臟組織視交叉前后各2mm厚的心臟組織，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中固定24h后，進(jìn)行石蠟包埋。將包埋好的腦組織蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，60%烤箱內(nèi)烤片1h進(jìn)行固定，進(jìn)行藥木精－伊紅（HE）染色，常規(guī)顯微鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用單因素ANOVA方法分析，若方差具齊性則用LSD檢驗(yàn)，若方差不具齊性則用Tamhane s T2檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 容積超負(fù)載模型的確認(rèn)

在ACS實(shí)施后1d分別測(cè)定各組的中心靜脈壓（central venous pressure，CVP）與左心室射血分?jǐn)?shù) （left ventricular end－diastolic pressure，LVEDP），ACS組的CVP與LVEDP明顯增高，這充分說(shuō)明了ACS手術(shù)增加了心臟在舒張末期的心室內(nèi)的血容量，從而加重了室壁的壓力（圖2）。

2.2 EGCG對(duì)超負(fù)荷導(dǎo)致的心臟質(zhì)量的變化的影響效果

通過(guò)每天對(duì)水的攝取量的測(cè)量發(fā)現(xiàn)，sham與ACS組并無(wú)明顯差異，但在 HW／BW 比率方面，ACS組相對(duì)于sham組增加了58%，而這份增加在EGCG組減小到了10.8%。在LW／BW及BW方面，ACS與EGCG組沒(méi)有顯著差異。這些結(jié)果與以往的關(guān)于EGCG對(duì)機(jī)體肝臟等其他組織器官無(wú)毒性的結(jié)論是相一致的［26］。這些結(jié)果顯示了EGCG對(duì)容積超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚有明顯的抑制作用（圖3）。

2.3 EGCG對(duì)心臟組織及心肌細(xì)胞的形態(tài)改變的影響效果

研究表明，與sham組比較，ACS組均明顯增加了心臟組織的體積及心肌細(xì)胞的面積。而這種容積超負(fù)荷導(dǎo)致的增大幾乎被EGCG完全抑制（圖4）。

2.4 EGCG對(duì)容積超負(fù)荷大鼠心臟的缺血再灌損傷的影響效果

在本研究中，我們還通過(guò)心臟離體灌注體系，檢測(cè)了EGCG對(duì)于心機(jī)能的影響（圖5）。結(jié)果表明，與ACS組比較，EGCG組明顯提高了缺血后的大鼠的心機(jī)能（圖5A）。在整個(gè)再灌過(guò)程中，與ACS組比較，LVEDP和冠脈血流量都得到了明顯的改善（圖5B，5C）。這些都顯示EGCG明顯改善了肥厚心肌的缺血再灌損傷。

3 討論

本研究首次體內(nèi)探討了EGCG關(guān)于容積超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚的生物學(xué)效應(yīng)?；诒狙芯康臄?shù)據(jù)，我們有理由相信EGCG具有作為有療效的心肌肥厚防治藥物開(kāi)發(fā)的潛質(zhì)。本研究還進(jìn)一步證明了EGCG不僅具有抑制心肌肥厚的效果，而且EGCG對(duì)心肌缺血再灌的損傷也有明顯的改善作用。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）已經(jīng)在很多細(xì)胞中被證明是一個(gè)重要的應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、增殖等細(xì)胞行為。在離體心肌細(xì)胞肥厚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，ROS被證明與心肌肥大有關(guān)聯(lián)［11］，并且可以調(diào)節(jié)機(jī)械拉伸、Angiotensin II及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）誘導(dǎo)的心肌肥厚［12－14］。EGCG 已經(jīng)被證明具有強(qiáng)效的抗氧化活性［15］，所以我們可以認(rèn)為抗氧化效應(yīng)是包含在EGCG預(yù)防容積超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的。

腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）同樣被報(bào)道在多種器官肥大的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中扮演著重要的角色［16］。交感神經(jīng)和全身腎素一血管緊張素系統(tǒng)在容積超負(fù)荷之后被報(bào)道發(fā)現(xiàn)活化［17］。然而，在離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，EGCG能夠抑制血管緊張素2調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［18］，所以，本研究中的EGCG的抗肥厚效果也有可能是通過(guò)阻斷RAS的作用而實(shí)現(xiàn)的，類似的結(jié)果也曾在其他幾種動(dòng)物模型中被證實(shí)［19，20］。所以，有必要深入探討EGCG的抗心肌肥厚的機(jī)理的研究。

心肌肥厚是針對(duì)于增加的室壁壓力的一種代償性反應(yīng)，對(duì)心肌細(xì)胞肥厚的抑制可能會(huì)導(dǎo)致一定程度的心力衰竭。所以在長(zhǎng)期的超負(fù)荷心臟中，為保持心肌功能在正常范圍內(nèi)被認(rèn)為是心肌肥厚的主要機(jī)制［21］。有報(bào)道說(shuō)，Cyclosporine A處理后，能夠抑制血壓超負(fù)荷心肌肥厚，保持心機(jī)能在正常范圍內(nèi)［22］。另一些研究表明心肌細(xì)胞肥厚與收縮障礙是相關(guān)聯(lián)的，這一關(guān)聯(lián)進(jìn)而增加了缺血再灌的損害［23，24］。我們通過(guò)檢測(cè)容積超負(fù)荷心臟在缺血再灌傷害后的心機(jī)能的恢復(fù)，從而明確了EGCG也具有心機(jī)能的維護(hù)效果，EGCG不僅有效抑制了心肌肥厚而且明顯改善了容積超負(fù)荷心臟的缺血再灌后的心機(jī)能的恢復(fù)。這個(gè)結(jié)果顯示了EGCG使心肌在未肥厚的狀態(tài)下適應(yīng)了容積超負(fù)荷。

眾所周知，Cyclosporine A與FK506等磷酸酶抑制劑具有抑制心肌肥厚的效果，但同時(shí)也兼有腎毒性與免疫抑制等副作用，從而限制了這類藥物的治療效果［25］。在本研究中，EGCG不僅抑制了容積超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚及心肌細(xì)胞形態(tài)變化的效果，而且對(duì)正常心臟及肝臟無(wú)明顯影響，也沒(méi)有任何關(guān)于正常成長(zhǎng)、體重增加及體力活動(dòng)方面的影響，因?yàn)榛颊叽蟛糠衷诖_診的時(shí)候已經(jīng)形成了心肌肥厚，所以更進(jìn)一步的研究有必要集中在EGCG是否可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的心肌肥厚，這將是更具有臨床的實(shí)際意義的研究。

總之，本研究證明了EGCG可以抑制容積超負(fù)荷導(dǎo)致的心肌肥厚及改善心機(jī)能。這些發(fā)現(xiàn)也許能帶來(lái)重要的關(guān)于預(yù)防心肌肥厚到心力衰竭轉(zhuǎn)變的新的臨床治療策略的暗示。

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