分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中上皮鈉通道m(xù)RNA的表達(dá)及其意義*

李祥翠 張奕 李吉平 王家東

·研究報(bào)告·

分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中上皮鈉通道
mRNA的表達(dá)及其意義*

李祥翠1張奕1李吉平1王家東1

目的 探討上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）m RNA在分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中的表達(dá)及其意義。方法 12只SD大鼠實(shí)驗(yàn)耳經(jīng)鼓膜注入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制造分泌性中耳炎（otitis media with effusion，OME）動(dòng)物模型，在造模后第二天取中耳黏膜，采用實(shí)時(shí)定量－聚合酶鏈反應(yīng)（real time－polymerase chain reaction，Red time PCR）檢測(cè)中耳黏膜中ENaC－mRNA的表達(dá)，并與對(duì)照耳（注入等量生理鹽水）相比較。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)耳α－、β－、γ－ENaC－m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.007 8、0.009 2、0.007 6，對(duì)照耳α－、β－、γ－ENaC－m RNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.012 1、0.012 6、0.011 7；實(shí)驗(yàn)耳相α－、β－、γ－ENaC－mRNA相對(duì)于對(duì)照組分別下調(diào)1.56倍（P＜0.05）、1.37倍（P＜0.05）、1.53倍（P＜0.01）。結(jié)論 ENaC在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜中基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下調(diào)，這可能是導(dǎo)致OME早期積液形成的機(jī)制之一。

中耳炎，分泌性； 上皮鈉通道； 實(shí)時(shí)定量－聚合酶鏈反應(yīng)

維持中耳腔的相對(duì)干燥狀態(tài)從而保證聲波從鼓膜正常地傳導(dǎo)至內(nèi)耳是中耳黏膜的基本生理功能之一。中耳黏膜和呼吸道黏膜具有同源性，即中耳黏膜表面亦覆蓋著氣道表面液體（airway surface liquid，ASL），其電解質(zhì)、水分的成分及量的相對(duì)恒定在維持中耳黏膜的相對(duì)干燥狀態(tài)中起著重要作用［1］。研究表明，上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）通過(guò)對(duì)離子和水的轉(zhuǎn)運(yùn)，在維持肺泡腔的液體平衡中起著重要作用，并能夠?qū)Ψ闻葜蟹e液進(jìn)行快速清除［2］。有研究表明中耳黏膜上皮同樣具有ENaC介導(dǎo)的液體吸收功能［1］。為了觀察分泌性中耳炎狀態(tài)下中耳黏膜ENaC的變化，本研究采用實(shí)時(shí)定量－聚合酶鏈反應(yīng)（real time－polymerase chain reaction，Red time PCR）技術(shù)從基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的大鼠OME模型中耳黏膜中ENaC－mRNA表達(dá)情況，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及造模［3］清潔級(jí)健康SD雄性大鼠12只（24耳），鼠齡5～7周，體重140～250克，無(wú)噪聲暴露和耳毒性藥物使用史，耳廓反射靈敏，解剖顯微鏡下外耳道、鼓膜均無(wú)異常，術(shù)前ABR、聲導(dǎo)抗檢測(cè)結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。大鼠苯巴比妥鈉（70 mg／kg）腹腔注射后，安爾碘消毒外耳道，采用微量注射器將200μg／ml的LPS 25μl經(jīng)鼓膜前下方注入試驗(yàn)耳，對(duì)照耳注入等量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)一編號(hào)，統(tǒng)一進(jìn)行飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 在動(dòng)物造模后第二天于苯巴比妥鈉（70 mg／kg）腹腔注射麻醉后，快速斷頭處死，取出聽(tīng)泡用去RNA酶處理的器械打開(kāi)聽(tīng)泡，在解剖顯微鏡下剝離中耳腔鼓岬、中下鼓室及咽鼓管周?chē)酿つ?，立即放入去RNA酶處理的離心管中，液氮保存，由于大鼠中耳黏膜量極少，故將每?jī)芍粍?dòng)物的中耳黏膜標(biāo)本合并為一份實(shí)驗(yàn)樣品，共6份樣品。應(yīng)用Trizol法抽提總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄為c DNA 取5μg總RNA＋1μl寡居脫氧核苷酸［Oligo（d T）20］＋1μl d NTP（10 mol／ml），用焦碳酸二乙酯水補(bǔ)足至總體積10μl；65℃變性5 min，立即置于冰上至少1 min；加入10μl合成互補(bǔ)DNA反應(yīng)混合液，該混合液（2μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、4μl MgCl2（25 mol／L）、2 μl DTT（0.1 mol／L）、1μl RNaseOUTTM（40 U／μl）、1μl Superscript TMⅢRT（200 U／μl）），50℃50 min互補(bǔ)DNA合成；85℃50 min終止反應(yīng)；加入1μl E.coliRNA酶H（2 U／μl），37℃20 min酶解殘留的RNA；－20℃保存。

1.2.3 Real time PCR反應(yīng) ①引物設(shè)計(jì)如下：α－ENaC（174 bp），正向引物：5′CAGTTCGCCTTGCTGTTCG3′，反向引物：5′AAGCGTCTGCTCCGTGAGT3′；β－ENaC（724 bp），正向引物：5′CAACACGACCTATTCCATCC3′，反向引物：5′AGCCTCAGGGAGTCATATG3′；γ－ENaC（286 bp），正向引物：5′ACAAAGACCTGAACCAAAG3′，反向引物5′GCATAGCAGAGGTAAAAGT3′；β－actin（211 bp，內(nèi)參照），正向引物：5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，反向引物：5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′。②PCR反應(yīng)體系：取100 ng模板互補(bǔ)DNA＋10μl 2×QuantiFast SYBRGREEN PCR Master Mix＋1μl正向引物（10μmol）＋1μl反向引物（10μmol），用不含RNA酶的水補(bǔ)足至總體積20 μl；每個(gè)樣本互補(bǔ)DNA的每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)孔。③95℃變性3 min；40個(gè)PCR循環(huán)（94℃，20秒；59℃，20秒；72℃，30秒）；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物與100 bp DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10－1、1×10－2、1 ×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8、1× 10－9這幾個(gè)濃度的DNA；將這幾個(gè)梯度稀釋的DNA模板以及所有的cDNA樣品分別配置Realtime PCR反應(yīng)體系，置于Realtime PCR反應(yīng)儀進(jìn)行PCR反應(yīng)?；?qū)崟r(shí)定量PCR反應(yīng)條件：95℃，5 min；40個(gè)PCR循環(huán)［（95℃，10秒；59℃，15秒；72℃，20秒；82.5℃（收集熒光），5秒］。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢升溫至99℃（每5秒升高1℃），建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，以鑒定產(chǎn)物是否單一。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)7 300 System Software軟件的分析，計(jì)算出樣本中各基因的循環(huán)閾值（CT值）。CT值經(jīng)對(duì)數(shù)擬合作圖，得到定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)E＝10（－1／slope）計(jì)算擴(kuò)增效率，采用管家基因β－actin（不同樣品間的表達(dá)量基本恒定）作為內(nèi)參來(lái)校正，待測(cè)樣品基因相對(duì)含量＝2－△CT（△CT＝待測(cè)基因CT－管家基因CT）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模后4～6小時(shí)解剖顯微鏡觀察所有大鼠的實(shí)驗(yàn)耳鼓膜渾濁，造模后第二天12只大鼠實(shí)驗(yàn)耳均現(xiàn)中耳積液，對(duì)照耳鼓膜透明，即12只試驗(yàn)耳均造模成功。大鼠實(shí)驗(yàn)耳中耳腔黏膜α－、β－、γ－ENaC－m RNA的轉(zhuǎn)錄相對(duì)于對(duì)照耳分別下調(diào)1.56倍、1.37倍和1.53倍（表1）。

表1 大鼠中耳黏膜上皮鈉通道m(xù)RNA相對(duì)表達(dá)量（ˉx±s）

3 討論

上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）介導(dǎo)的液體吸收在各種組織的鈉、水平衡中起著重要的作用，已有研究表明ENaC分布在各級(jí)呼吸道（從鼻咽到細(xì)支氣管）上皮細(xì)胞的腔頂面［4］，對(duì)維持氣道黏膜ASL的穩(wěn)定性起著重要作用［5］。Choi等［6］采用改良的Ussing室宏觀電生理測(cè)量方法研究發(fā)現(xiàn)中耳黏膜上皮細(xì)胞ENaC介導(dǎo)的amiloride敏感的的短路循環(huán)電流（amiloride－sensitive Isc）顯著高于鼻黏膜上皮細(xì)胞，由于ENaC介導(dǎo)的Isc反應(yīng)細(xì)胞對(duì)Na＋的吸收能力，故ENaC在中耳黏膜上皮細(xì)胞的離子轉(zhuǎn)運(yùn)較鼻黏膜上皮細(xì)胞大，這可能與人中耳黏膜上皮細(xì)胞要保持中耳腔的相對(duì)干燥狀態(tài)有關(guān)；通過(guò)Western blot檢測(cè)對(duì)比兩種組織中的ENaC三個(gè)亞基的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，中耳黏膜組中的ENaC蛋白表達(dá)顯著高于鼻黏膜組；該研究進(jìn)一步通過(guò)比較兩者的amiloride敏感液體吸收率發(fā)現(xiàn)，中耳黏膜的液體吸收率顯著快于鼻黏膜，進(jìn)一步從功能上證實(shí)ENaC在中耳黏膜上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用的重要性，在維持中耳腔黏膜的較薄的ASL的穩(wěn)定性中起著重要作用。另有研究［7～9］也表明體外培養(yǎng)的中耳黏膜上皮細(xì)胞也有ENaC表達(dá)且在積液吸收中起著主導(dǎo)作用。近年來(lái)，本課題組［10，11］報(bào)道了健康大鼠的中耳黏膜具有ENaC介導(dǎo)的鈉、水轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)一步在活體中證實(shí)了ENaC介導(dǎo)的液體吸收在中耳生理學(xué)中的作用。

以上研究均是在正常情況下研究ENaC在中耳黏膜上皮細(xì)胞離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，那么在病理狀態(tài)下（如OME）下，ENaC是否也發(fā)揮著同樣的作用呢？本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)比研究OME模型豚鼠實(shí)驗(yàn)耳與對(duì)照耳ENaC－m RNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn)與對(duì)照耳相比，實(shí)驗(yàn)耳α－、β－、γ－ENaC－mRNA的轉(zhuǎn)錄均顯著下調(diào)，即在炎癥早期，ENaC在中耳黏膜的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這與Choi等［7］的研究結(jié)果相對(duì)一致。因?yàn)镮L－1β是重要的早期炎癥反應(yīng)因子之一且在OME中表達(dá)上升［12］，通過(guò)對(duì)比IL－1β處理組（10 ng／ml培養(yǎng)液中處理24小時(shí)）與正常組的人中耳黏膜上皮細(xì)胞的ENaC的mRNA轉(zhuǎn)錄及amiloride敏感的的Isc發(fā)現(xiàn)：IL－1β處理后ENaC介導(dǎo)的Isc從14.2±1.3μA／cm2降至10.3± 1.4μA／cm2（P＜0.05），α、β－ENaC－m RNA相對(duì)減少16%、41%，而γ－ENaC－mRNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯變化，由此推斷人中耳黏膜上皮細(xì)胞的ENaC在早期炎癥因子（IL－1β）的作用下在基因轉(zhuǎn)錄及功能等方面呈抑制狀態(tài)，使中耳黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子功能下降，從而導(dǎo)致中耳積液，這可能是OME早期積液形成的機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)在OME造模成功后第二天（即炎癥早期）中耳黏膜組織ENaC的轉(zhuǎn)錄呈下調(diào)狀態(tài)，那么ENaC在OME的中晚期表達(dá)是否亦呈抑制狀態(tài)呢？Song等［13］通過(guò)堵塞健康大鼠咽鼓管誘導(dǎo)OME后研究ENaC在病理狀態(tài)下的表達(dá)，在咽鼓管堵塞后的第2、4、8周（即炎癥中、晚期）取大鼠實(shí)驗(yàn)耳和對(duì)照耳聽(tīng)泡分別用PCR測(cè)定ENaC－m RNA的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)α－ENaC－mRNA在第2、4周的轉(zhuǎn)錄顯著降低，但在第8周卻顯著增加至對(duì)照組的1.48倍；β－ENaC－mRNA在第2周時(shí)兩組無(wú)明顯差異，而在第4、8周時(shí)則顯著增加；而γ－ENaC－mRNA在第2、4、8周均呈顯著增加，故推測(cè)ENaC的表達(dá)可能與中耳黏膜組織暴露于炎癥狀態(tài)的時(shí)程有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。由于存在m RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制，炎癥早期ENaC的基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)是否影響ENaC的蛋白表達(dá)及其功能有待進(jìn)一步的研究?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼓膜注入LPS誘導(dǎo)的分泌性中耳炎大鼠模型中，在OME早期ENaC基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，這可能是OME早期積液形成的機(jī)制之一，其分子生物學(xué)基礎(chǔ)及其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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（2011－02－11收稿）

（本文編輯 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006－7299.2011.05.020

時(shí)間：2011－9－5 14：59

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1006－7299（2011）05－0457－03

* 上海市衛(wèi)生局科研課題計(jì)劃（2007Y02）、上海交通大學(xué)“醫(yī)工（理）交叉研究基金”項(xiàng)目（YG2010MS28）聯(lián)合資助

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科、上海交通大學(xué)（醫(yī)學(xué)院）耳鼻咽喉科研究所（上海 200127）

李吉平（Email：lijp74＠yahoo.com.cn）

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