張奕強(qiáng),劉文倩,劉永生,王 印,姚學(xué)萍,張 杰

2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室,雅安625014

豬鏈球菌(Streptococcus suis)屬球菌科(Coccaceae),鏈球菌屬(Streptococcus),為革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌。根據(jù)莢膜多糖抗原差異,可將其分為35個(gè)血清型,分別為1/2型及1～34型。該菌感染宿主范圍寬,致病性強(qiáng),豬感染后可發(fā)生淋巴結(jié)膿腫、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及敗血癥等癥狀,并且人通過(guò)特定的傳播途徑亦可感染該菌[1-2]。國(guó)外自1968年丹麥?zhǔn)状螆?bào)道了豬鏈球菌導(dǎo)致人嚴(yán)重感染病例后,已有數(shù)十個(gè)國(guó)家報(bào)道了此類(lèi)病例,在1968-1989年間,全球共報(bào)道人感染Ⅱ型鏈球菌病例108例[3-4]。1998年江蘇發(fā)生豬鏈球菌小范圍爆發(fā)[5],2005年6-8月四川省發(fā)生了人-豬鏈球菌病疫情,導(dǎo)致204人感染,38人死亡,引起了國(guó)內(nèi)外的重視[6]。仔豬感染豬鏈球菌后的病死率達(dá) 10%～25%,育肥豬的發(fā)病率為 2%～20%,死亡率逐年升高,嚴(yán)重威脅全國(guó)的生豬養(yǎng)殖業(yè),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于臨床上常見(jiàn)豬鏈球菌與豬瘟、豬偽狂犬病、豬肺疫、藍(lán)耳病等混合感染或繼發(fā)感染,這不僅使病情復(fù)雜化,而且增大了病死率和防治的難度[7],所以建立良好的動(dòng)物感染模型,對(duì)研究豬鏈球菌感染的致病機(jī)理,以及其與宿主之間的相互作用有極其重要的意義,對(duì)開(kāi)發(fā)防治豬鏈球菌感染的藥物和疫苗有積極作用。本文旨在觀察豬鏈球菌感染BALB/c小鼠后的各種臨床癥狀,各器官大體病變,并通過(guò)病理切片從組織學(xué)水平觀察、分析各器官病變,為將BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)室研究豬鏈球菌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 SS-sic05株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室于2005年分離自四川某豬場(chǎng)一病死仔豬淋巴結(jié)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8周齡,體重 16～20g,體況良好的BALB/c小鼠14只,雌雄各半,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的感染 將菌種接種10%血瓊脂平板(按文獻(xiàn)8所述方法配制)在有氧條件下置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,用適量PBS洗下菌落。菌液按麥?zhǔn)媳葷岱ù_定濃度,然后將其稀釋到約1×109CFU/mL,經(jīng)腹腔注射感染10只小鼠,雌雄各半,每只注射0.2mL,另取4只注射等量PBS作為對(duì)照。每日觀察感染后小鼠的各種行為及癥狀并做記錄。

1.4 病死小鼠的解剖及病理切片制作 無(wú)菌選取病變組織或器官接種10%血瓊脂平板作病原的分離鑒定,并將選取的病變組織或器官浸泡于10%中性福爾馬林中固定。將經(jīng)固定的樣品做常規(guī)脫水,石蠟包埋,連續(xù)切片,切片厚度5μ m,HE染色后觀察、拍照。

1.5 病原的分離 將1.2.2中所述血瓊脂平板置于37℃溫箱培養(yǎng)24～48h,挑取平板上單個(gè)菌落作革蘭氏染色,觀察其形態(tài)和染色特性,根據(jù)鏡檢結(jié)果挑取疑似鏈球菌的單個(gè)菌落作純化培養(yǎng),分別接種于血瓊脂平板和血清肉湯(按文獻(xiàn)8所述方法配制)。

1.6 PCR鑒定 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(購(gòu)自 TianGen公司)提取純化后的疑似菌株的DNA,選用能擴(kuò)增大多數(shù)細(xì)菌的近乎全長(zhǎng)的 16s RNA基因的通用引物對(duì)27F/1522R[9](由上海生工生物工程有限公司合成,序列見(jiàn)表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(購(gòu)自AXYGEN公司)回收后連接pMD-18T載體(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司),轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自TianGen公司),經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒載體雙酶切鑒定后,挑選陽(yáng)性克隆送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行Blast比對(duì)。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;然后94℃變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5min,循環(huán)35次;最后72℃延伸10min。

表1 用于擴(kuò)增豬鏈球菌16s RNA基因的通用引物T able 1 Primers for amplification of 16s RNA fragment from Streptococcussuis

1.7 生化試驗(yàn) 將血清肉湯中的菌液以無(wú)菌操作分別對(duì)葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、尿素、七葉苷、水楊素生化發(fā)酵管(購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司)作穿刺接種。接種后,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷依據(jù)參照文獻(xiàn)10。

1.8 藥敏試驗(yàn) 用先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋肟、氯霉素、紅霉素、新霉素、四環(huán)素、青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、苯唑青霉素和氧哌嗪青霉素等12種常用抗菌藥物的藥敏紙片(購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司)對(duì)分離菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將分離菌用接種環(huán)致密劃線(xiàn)于鮮血瓊脂平板,用無(wú)菌鑷子將以上抗菌藥物的藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基表面,各片距離要相等,37℃培養(yǎng)24h后觀察測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)以抑菌圈直徑小于10mm為耐藥,直徑在10～15mm為中度敏感,直徑大于15mm以上為高度敏感[11]。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠致病性 感染3d后對(duì)照組小鼠均健康存活;實(shí)驗(yàn)組小鼠感染9h后開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡,隨后先后出現(xiàn)扎堆、顫抖、厭食、四肢癱瘓等癥狀。第一只小鼠死亡時(shí)間是感染22h后,感染68h后最后1只小鼠死亡。死后解剖可見(jiàn)皮下出血,血液凝固不良;打開(kāi)腹腔可見(jiàn)腸道有多量漿液性滲出,小腸腸壁變薄并充滿(mǎn)黃色液狀內(nèi)容物,見(jiàn)圖1。肝臟明顯淤血或出血,質(zhì)地易碎,見(jiàn)圖2。脾臟腫大,邊緣鈍圓,有明顯出血或淤血,見(jiàn)圖3。腎臟一定程度腫脹,有淤血或出血;打開(kāi)胸腔可見(jiàn)肺部有明顯的出血或淤血,嚴(yán)重者可在其表面見(jiàn)灰白色壞死灶或發(fā)生肺肉變,見(jiàn)圖4。

圖1 小腸腸炎Fig.1 Enteritis

2.2 組織病理變化 小鼠肺部出現(xiàn)以充血、出血以及炎性細(xì)胞大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主的病理變化,見(jiàn)圖5。肝臟中央靜脈以及肝血竇明顯淤血,肝細(xì)胞顆粒變性,后期發(fā)生凝固性壞死,并伴有大量嗜中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),見(jiàn)圖6。脾臟大量炎性細(xì)胞增生,包括多核巨細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞增生,見(jiàn)圖7。腎臟的腎小球毛細(xì)血管出血,腎間質(zhì)出血,腎小管上皮細(xì)胞胞核固縮、溶解,細(xì)胞腫脹、破裂,腎小管結(jié)構(gòu)崩解,見(jiàn)圖8。

2.3 分離細(xì)菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性 37℃恒溫培養(yǎng)24h后,在血瓊脂培養(yǎng)基上形成表面光滑、透明、圓形、濕潤(rùn)、邊緣整齊、針尖大小的露滴樣的無(wú)色小菌落,直徑約1mm。并且在菌落周?chē)纬擅黠@的β溶血環(huán),直徑3～5mm。在血清肉湯試管底部形成絮狀沉淀,上部澄清。顯微鏡檢查均為革蘭氏陽(yáng)性球菌,鮮血瓊脂平板培養(yǎng)物中多呈2～5個(gè)短鏈狀排列,血清肉湯培養(yǎng)物呈長(zhǎng)鏈狀排列。

2.4 生化試驗(yàn) 生化糖發(fā)酵管的結(jié)果與豬鏈球菌的生化特性相符,見(jiàn)表2,說(shuō)明該分離菌株為豬鏈球菌。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果T able 2 Result of biochemistry properties test

2.5 16s RNA鑒定 經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出現(xiàn)了一條約1500bp的條帶,與預(yù)期片段大小相當(dāng),見(jiàn)圖9。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,連接pMD-18T載體,經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒載體雙酶切鑒定后(圖10),挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)序。將所得測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì),其16s RNA與Streptococcussuis P1/7(AM946016.1),Streptococcus suis SC84(FM252031.1)以及 Streptococcus suis BM407(FM252032.1)等菌株的16s RNA同源性達(dá)99%,僅有幾個(gè)堿基差別,再次證明該菌株為豬鏈球菌。

2.6 藥敏試驗(yàn) 12種藥物所形成的抑菌圈的直徑見(jiàn)如表3。從不同藥物產(chǎn)生的抑菌圈的直徑可以看出:所用的12種藥物對(duì)豬鏈球菌均有不同程度的抑菌作用。該菌株對(duì)先鋒霉素Ⅴ、先鋒霉素Ⅵ、頭孢呋肟、氯霉素、紅霉素、青霉素、氨芐青霉素、羧芐青霉素、苯唑青霉素和氧哌嗪青霉素高度敏感,而對(duì)新霉素中度敏感,對(duì)四環(huán)素耐藥。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sensitivity to antibiotics

3 討 論

隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,豬鏈球菌感染及流行嚴(yán)重威脅著世界各國(guó)的生豬養(yǎng)殖業(yè),導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2005年四川所暴發(fā)的人-豬鏈球菌病疫情更是引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。因而建立合適的動(dòng)物模型,對(duì)于展開(kāi)豬鏈球菌的致病機(jī)理及免疫機(jī)制等的深入研究就顯得尤為重要。小鼠因其具有遺傳背景清楚,個(gè)體差異小,飼養(yǎng)管理方便,費(fèi)用相對(duì)低廉以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)相對(duì)成熟等優(yōu)點(diǎn),所以成為大多數(shù)研究者優(yōu)先考慮的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Daminguez-Punaro等[12]在以豬鏈球菌血源性感染CD1小鼠成功建立感染模型的基礎(chǔ)上,又進(jìn)一步建立了C57BL/6和A/J小鼠模型,并進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)兩種小鼠對(duì)豬鏈球菌都敏感,A/J小鼠在早期感染中更為敏感,說(shuō)明小鼠可以作為豬鏈球菌感染的動(dòng)物模型。

本研究中,通過(guò)分離細(xì)菌的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)和PCR鑒定結(jié)果,表明小鼠確由感染豬鏈球菌致死,體內(nèi)各組織器官病變均由感染豬鏈球菌而引起。通過(guò)解剖和組織學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)小鼠全身皮膚、漿膜、粘膜及各主要器官發(fā)生不同程度的出血與淤血,即在BALB/c小鼠上成功模擬出典型的敗血癥病變,說(shuō)明BALB/c小鼠能夠作為良好的實(shí)驗(yàn)室研究豬鏈球菌的感染動(dòng)物。值得一提的是,小鼠感染豬鏈球菌后,在各主要器官發(fā)生大量嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí),脾臟的淋巴細(xì)胞卻在減少。這可能是由于在發(fā)生急性脾炎時(shí),脾臟的淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生彌漫性或局灶性的壞死、崩解,致使脾臟固有的組織細(xì)胞成分明顯減少,增生的嗜中性粒細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞除了要清除病原菌外,還要吞噬、清除壞死區(qū)崩解、破碎后的細(xì)胞成分,所以在顯微鏡下觀察脾臟的實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。

根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果可以知道,通常的抗革蘭氏陽(yáng)性菌的藥物對(duì)該株豬鏈球菌均有一定的作用,但是四環(huán)素與氨基糖苷類(lèi)的新霉素效果不佳,可能是由于該株豬鏈球菌對(duì)四環(huán)素與新霉素產(chǎn)生了耐藥性。紅霉素、氯霉素、青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)藥物的效果十分良好,可以用于臨床上對(duì)患病動(dòng)物的治療。但是,由于各地各個(gè)豬場(chǎng)豬鏈球菌的流行情況與平常用藥的情況不盡相同,所以此藥敏試驗(yàn)的結(jié)果僅供參考。再次,在治療時(shí)應(yīng)根據(jù)患病動(dòng)物的癥狀,正確的選擇特異有效的抗生素,注意用藥劑量和療程,不能濫用抗生素。

目前為止,雖然已有許多有關(guān)豬鏈球菌動(dòng)物感染模型的報(bào)道,各類(lèi)動(dòng)物模型各有特點(diǎn),但是對(duì)于動(dòng)物模型的選擇還是沒(méi)有定論。所以,還要不斷地對(duì)豬鏈球菌的動(dòng)物感染模型進(jìn)行研究,改良出能更真實(shí)地反映豬鏈球菌感染后各種病理生理變化過(guò)程的動(dòng)物模型,更好地開(kāi)發(fā)出防治豬鏈球菌的藥物和疫苗,來(lái)更有效地防控豬鏈球菌病的危害。

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